通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，包括：构建重组腺相关病毒；将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O

【技术实现步骤摘要】
通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，俗称老年性痴呆，是多因素疾病，老化是其最主要的病因。AD拥有典型的病理特征：细胞外β
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淀粉样蛋白(β
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amyloidprotein,Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)的沉积和细胞内大量的tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和广泛神经元退变。一直以来在AD研究领域都是以Aβ为中心，以Aβ为靶标作为药物开发的重点。遗憾的是AD一直是新药研发的重灾区，该领域临床试验失败率高达99.6％，过去20年来在该领域的研究几乎全军覆没，所以寻找新的靶点非常必要。
[0003]NFTs聚集的其数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经元纤维退化(neurofibrillary degeneration)的病理基础。而tau的异常过度磷酸化被认为是引起NFTs聚集和tau朊样传播的一个重要因素。为进一步证实tau病理发生、发展与磷酸化的关系，以及开发以tau为靶标的AD药物，我们拟过表达使tau发生去磷酸化的酶PP2A并观察tau朊样传播的变化。
[0004]PP2A，即蛋白磷酸酶2，是一种酶，在人类中由PPP2CA基因编码，是异源三聚体，由催化亚单位C，结构亚单位A和调节亚单位B组成。是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，调节真核细胞中大部分的磷酸化酶，对细胞内的许多通路产生影响。
[0005]重组腺相关病毒rAAV是在非致病的野生型腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)基础上改造而成的基因载体，具有免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势，被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。rAAV载体种类多样，有众多血清型，不同血清型的rAAV载体可以识别不同的细胞表面受体，表现出不同组织或细胞感染嗜亲性。
[0006]近年来，基因治疗作为全球最引人注目的新型疗法快速发展，rAAV作为基因治疗的明星载体，一直是人们广泛关注的重点。本项研究的结果显示rAAV9可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，通过病毒载体介导PP2A基因的过表达，增加tau的去磷酸化作用，从而研究tau病理发生的分子机制，明确tau病理聚集和朊样传播与tau磷酸化水平以及PP2A的关系，提示了rAAV载体介导的基因治疗的可行性，亦可有助于筛选出抑制或逆转tau病理发生发展及传播的药物，为此类疾病的治疗提供了新的策略。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于明确tau病理发生、发展和tau的磷酸化水平以及PP2A的关系，构建了一种重组腺相关病毒rAAV9
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Ppp2ca，通过过表达PP2A，增加tau的去磷酸化，观察AD O
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tau对tau朊样传播的影响。
[0008]本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，包括以下步骤：
[0010]1)构建重组腺相关病毒：构建目的基因过表达载体，并进行包装及滴度的检测；
[0011]2)将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；
[0012]3)将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O
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tau的分离；
[0013]4)将步骤3)分离后的AD O
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tau注射小鼠海马；
[0014]5)组织固定与切片；
[0015]6)免疫组织化学；
[0016]7)蛋白质免疫印迹。
[0017]进一步的，步骤1)所述构建的重组腺相关病毒载体为rAAV9；所述构建目的基因过表达载体，其目的基因为Ppp2ca，载体名称为CV235，酶切位点为BamHI/AgeI。
[0018]进一步的，步骤1)所述病毒滴度的检测方法采用定量PCR法。
[0019]进一步的，所述腺相关病毒为rAAV9
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Ppp2ca，病毒滴度能够达到1.67E+12vg/ml。
[0020]进一步的，步骤2)所述在小鼠脑室注射的坐标为：前囟向后0.5mm，向左/右旁开1.0mm，自硬膜向腹侧进针2.5mm；注射体积5μl，注射速度0.2μl/min，留针10min以防液体外溢。
[0021]进一步的，步骤3)所述分离的具体步骤包括：
[0022]将10％的AD脑匀浆液在4℃下，27000xg离心30min，取上清在4℃下235000xg离心45min，将沉淀Oligo
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tau用生理盐水洗三次，再用生理盐水重悬，
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80℃保存，得到的tau即为AD O
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tau。
[0023]进一步的，步骤4)所述在小鼠海马注射的坐标为：前囟向后2.5mm，向左/右旁开2.0mm，自硬膜向腹侧进针1.8mm；注射体积2.5μl，注射速度1.25μl/min，留针3min以防液体外溢。
[0024]进一步的，步骤7)所述蛋白质免疫印迹包括以下步骤：
[0025]71)样品处理：分别取步骤4)中注射了AD O
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tau的小鼠两侧海马组织，即注射病毒侧和注射病毒的对侧，在10倍体积匀浆液中4℃匀浆，按1:1加入2
×
Laemmli SDS样品缓冲液，沸水煮5min,用Pierce
TM 660nm蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度；
[0026]72)检测tau及其磷酸化时配制10％SDS
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PAGE，相同量的蛋白上样，电压积层胶90V、分离胶110V，电泳；
[0027]73)电泳结束后采用湿转法将样品转移至PVDF膜，恒流1.0A，70min；
[0028]74)转膜结束后，将膜裁剪下干燥后再次用甲醇激活，TBS清洗一次后放入含有5％脱脂奶粉的TBS封闭30min；
[0029]75)加入含有5％脱脂奶粉和0.1％叠氮钠的TBS配置的一抗，4℃过夜；
[0030]76)TBS
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T漂洗15min
×
3次，TBS漂洗15min
×
1次；加入用含有5％脱脂奶粉TBS配置的二抗，室温2h；
[0031]77)TBS
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T漂洗15min
×
3次，TBS漂洗15min
×
1次，将膜置于ECL显色液中，临用前鲁米诺和过氧化氢等体积混匀，室温1min；压片、曝光、显影。
[0032]进一步的，步骤71)所述匀浆液包括：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4；8.5％蔗糖；10mMβ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建重组腺相关病毒：构建目的基因过表达载体，并进行包装及滴度的检测；2)将构建好的腺相关病毒通过脑室注射方式注射小鼠右侧脑室；3)将AD患者脑内提取的病理性tau即AD O
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tau的分离；4)将步骤3)分离后的AD O
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tau注射小鼠海马；5)组织固定与切片；6)免疫组织化学；7)蛋白质免疫印迹。2.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤1)所述构建的重组腺相关病毒载体为rAAV9；所述构建目的基因过表达载体，其目的基因为Ppp2ca，载体名称为CV235，酶切位点为BamHI/AgeI。3.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤1)所述病毒滴度的检测方法采用定量PCR法。4.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，所述腺相关病毒为rAAV9
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Ppp2ca，病毒滴度能够达到1.67E+12vg/ml。5.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤2)所述在小鼠脑室注射的坐标为：前囟向后0.5mm，向左/右旁开1.0mm，自硬膜向腹侧进针2.5mm；注射体积5μl，注射速度0.2μl/min，留针10min以防液体外溢。6.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤3)所述分离的具体步骤包括：将10％的AD脑匀浆液在4℃下，27000xg离心30min，取上清在4℃下235000xg离心45min，将沉淀Oligo
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tau用生理盐水洗三次，再用生理盐水重悬，
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80℃保存，得到的tau即为AD O
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tau。7.根据权利要求1所述一种通过腺相关病毒介导的抑制tau病理朊样传播的方法，其特征在于，步骤4)所述在小鼠海马注射的坐标为：前囟向后2.5mm，向左/右旁开2.0mm，自硬膜向腹侧进...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳，周鼎伟，吴若桢，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：