用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接的启动子、杂合内含子和编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列。本发明专利技术还公开了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列和引导运动神经元存活蛋白的核酸序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。本发明专利技术还公开了所述重组腺相关病毒用于更有效地、起效快地治疗脊髓性肌萎缩的用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途


[0001]本专利技术涉及基因治疗领域，尤其涉及用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种运动神经元退行性的罕见病，该病以脊髓前角运动神经元变性为特征，有时也可累及脑干运动神经元。临床上主要表现为运动神经元进行性、对称性肌无力和萎缩，近端重于远端，下肢重于上肢。由于肌肉无力，呼吸、运动和吞咽等均有影响。在美国，新生婴儿中的发病率为1/6000
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10000，人群中携带率为1/40
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60。国内的发病情况尚无官方统计，因该病的发病无种族特异性，推测国内共有患者3
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5万人，每年新增1500
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2500患者。
[0003]SMA发病与5号染色体中SMN基因突变有关，SMN编码全长的SMN(SMN
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fl)，其编码蛋白全长包含294个氨基酸，分子量为38kD。SMN分子在细胞质和细胞核内表达，主要与分子转录调控有关。SMN与Gemins等分子形成蛋白复合体，与snRNP复合物相互结合进入细胞核，形成gem body(简称GB)，调控细胞内基因的转录。细胞中缺失SMN分子，转录水平降低，在运动神经元中尤其明显，造成运动神经元活性下降，从而使神经突触连接减少，肌肉活力降低。人体内共有两个SMN等位基因，靠近端粒的SMNl及靠近着丝粒的SMN2。两者高度同源，在编码区内的差异仅外显子7的同义突变，其他差异均位于非编码区。SMNl基因表达产物90％为功能性SMN蛋白，而SMN2基因转录本90％缺少外显子7，只有10％的包含外显子7的转录本，仅表达10％左右的功能性SMN蛋白。SMA患者的SMN1基因缺失，SMN2基因的第7个外显子突变导致SMN蛋白水平降低。根据SMN2基因中第7个外显子的突变拷贝数，可以将患者分为4种类型。SMAI型患者一般在出生后2周到3月内发病，肌肉张力严重衰竭，患儿很难坐立，2岁左右因呼吸衰竭去世；II型患者一般在6
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18月内发病，能够坐立，却很难独立行走，一般在成年后死亡；III型患者随着年龄的增大，慢慢丧失行走能力，但是寿命正常；IV型患者一般在青少年发病，有轻微的运动障碍，寿命不受影响。由于SMA尚未被国家纳入新生儿疾病的筛查体系，推测未来10
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20年国内的SMA患者数量稳定增加。
[0004]FDA批准上市第一个SMA药物是Biogen公司研发的反义寡核苷酸药物(ISIS
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SMNRx)，其通过修饰SMN2基因的前信使RNA剪接，从而产生正常的SMN蛋白，主要治疗II型SMA病人。但是，该药物服用后易造成泌尿系统毒性，易使患者的血小板降低和导致凝血障碍等不良反应。研发一种对患者疗效更安全、适应症更广泛的药物是未来的研发方向。2019年5月，FDA批准了诺华公司的基因治疗药物Zolgensma，该药物使用非复制型腺相关病毒作为人SMN功能性基因的递送载体来治疗SMA患者，虽然取得一定治疗效果，但价格昂贵，一般普通患者消费不起。因此，对于SMA疾病，我国目前仍迫切需要一种能广泛接受且更有效治疗SMA的药物以及方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于单基因突变导致患者体内缺失SMN分子的发病机制，通过基因治疗方法在患者体内直接补充SMN基因。候选药物用双链AAV腺相关病毒载体携带正常的SMN基因进入脊髓，通过转录和翻译，产生适应体内环境的正常SMN蛋白。
[0006]在一方面，本专利技术提供了一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接的启动子、杂合内含子和编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列。
[0007]在一方面，本专利技术提供了一种重组载体，其包含本文中所述的重组核酸分子。
[0008]在另一方面，本专利技术提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含AAV反向末端重复序列(ITR)、编码运动神经元存活蛋白(SMN)的核酸序列和引导SMN在宿主细胞中表达的表达控制序列。
[0009]在某些实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)是自身互补腺相关病毒(scAAV)。
[0010]在某些实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)是重组的AAV2/9腺相关病毒。
[0011]在另一方面，本专利技术涉及适于鞘内施用于动物受试者的具有AAV衣壳的重组腺相关病毒(rAAV)，所述AAV衣壳内包封含有AAV ITR(反向末端重复序列)及受调节元件控制的编码SMN的核酸，所述调节元件引导SMN在宿主细胞中表达(“rAAV.SMN”)。此类rAAV.SMN是复制缺陷型的，并有利地可用于将SMN递送至诊断患有SMN缺陷的受试者的CNS；特别是诊断患有SMA的人受试者。在一个优选实施方案中，该rAAV.SMN转导脑和脊髓中的神经元，且特别是运动神经元。在另一优选实施方案中，本专利技术的rAAV.SMN未被可能存在于待治疗的受试者中的AAV9衣壳的抗血清所中和。在某些实施方案中，该核酸序列编码SEQ ID NO:9或10或与其共享至少95％同一性的序列。
[0012]在某些实施方案中，编码人SMN蛋白(“hSMN”)的核酸序列可以是密码子优化的。参见例如，编码该SMN蛋白的核酸序列是SEQ ID NO:6的SMN序列，或与其共享至少70％同一性的序列。
[0013]在另一方面，本专利技术提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文中所述的重组载体或重组腺相关病毒(rAAV)。
[0014]在另一方面，本专利技术提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和如本文中所述的重组腺相关病毒(rAAV)。
[0015]在另一方面，本专利技术提供了本文中所述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒(rAAV)、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗的脊髓性肌萎缩药物中的用途。
[0016]在又一方面，本专利技术提供了在受试者中治疗脊髓性肌萎缩的方法。该方法包括向需要其的受试者施用如本文中所述的药物组合物。
[0017]本专利技术提供一种更有效地、起效快地用于治疗脊髓性肌萎缩的重组腺相关病毒(rAAV)。
[0018]下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。
附图说明
[0019]图1示出了pSC
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CMV的质粒图谱。
[0020]图2示出了ITR间插入片段的两种不同结构。
[0021]图3示出了pSNAV2.0
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CAG
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EGFP的质粒图谱。
[0022]图4A示出了L
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G1和L
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G2重组质粒在293细胞中的转染效率(24h)。其中F表示荧光，L表示白光。图4B示出了L
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G1和L
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组核酸分子，其包含可操作的依次连接的启动子、杂合内含子和编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列。2.权利要求1所述的重组核酸分子，其中，所述启动子是CAG启动子，其包含巨细胞病毒早期增强子元件和鸡β
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肌动蛋白启动子；所述杂合内含子序列如SEQ ID NO:3所示。3.权利要求2所述的重组核酸分子，其中，所述巨细胞病毒早期增强子元件具有选自以下的多核苷酸序列：1)SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列；2)SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO:1具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；优选地，所述鸡β
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肌动蛋白启动子具有选自以下的多核苷酸序列：1)SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列；2)SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO:2具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。4.权利要求1
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3中任一所述的重组核酸分子，其中，所述编码功能性运动神经元存活蛋白的核酸序列具有选自以下的多核苷酸序列：1)SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示多核苷酸序列；2)SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；更优选地，所述多核苷酸序列是密码子优化的序列。5.权利要求1
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4中任一所述的重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子还包含多聚腺苷酸、Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种；其中，所述多聚腺苷酸具有选自以下的多核苷酸序列：1)SEQ ID NO:7所示多核苷酸序列；2)SEQ ID NO:7所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO:7具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。6.权利要求1
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5中任一所述的重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子包含SEQ ID NO:4所示的多核苷酸序列；优选地，所述重组核酸分子具有选自以下的多核苷酸序列：
1)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示多核苷酸序列；2)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，蒋立新，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：