多任务处理调控组件以识别细胞类型特异性调控组件制造技术

本申请提供一种用于筛选及识别在所关注的特定细胞类型中提供选择性表达的调控组件的高通量方法。还提供用于该高通量筛选方法中的核酸组合物。的核酸组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多任务处理调控组件以识别细胞类型特异性调控组件
本申请案主张2019年3月22日申请的美国临时专利申请案第62/822,528号的优先权益，其以引用的方式并入本申请中。

技术介绍

[0001]近年来，已利用基因疗法治疗疾病的临床试验的数目已不断地增加。这些临床试验面临的主要挑战之一为控制治疗性基因的表达量或沉默水平的能力，以便在治疗功效与因治疗蛋白或基于RNA干扰的序列的过度表达引起的非特定毒性之间提供平衡。具体而言，达成治疗有关剂量所需的转基因表达量基于特定疾病的固有病理生理学及转基因产物的性质(例如，细胞内与细胞外，结构与酶功能)而变化。另外，转基因的细胞特异性表达为特别需要的，因为其提供选择性靶向病理相关性细胞类型(例如，癌细胞)的能力且降低患者中不良事件的可能性。因此，需要识别用于将基因疗法或基因表达靶向所关注组织或细胞类型的调控组件及其使用方法，其可减少脱靶效应，增加目标组织及/或细胞类型中的治疗功效，且通过降低达成功效所需要的有效剂量来增加患者安全性及耐受性。

技术实现思路

[0002]在一些实施方案中，本专利技术提供一种识别于给定细胞类型中提供选择性表达的调控组件的方法，其包含：a)向细胞提供载体的混合物，这些载体各自包含可操作地连接于转基因的候选调控组件，其中各载体进一步包含条形码(barcode)；b)自表达该转基因的复数个单细胞中分离RNA；c)通过测序单细胞中的每一者的转录组(transcriptome)来识别这些单细胞中的每一者；及d)使转录组中的条形码与候选调控组件相关联，从而识别在该细胞类型中提供选择性表达的调控组件。在一些实施方案中，调控组件选择性地增加细胞类型中转基因的表达。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与不同细胞类型中相同调控组件的转基因的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与不同细胞类型中相同调控组件的转基因的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与不同细胞类
型中相同调控组件的转基因的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件在一种细胞类型中提供相对于至少一种其他细胞类型的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，与兴奋性神经元相比，调控组件在GABA能神经元中提供转基因的选择性表达。在其他实施方案中，调控组件在GABA能神经元亚型，诸如表达谷氨酸脱羧酶2(decarboxylase 2；GAD2)、GAD1、NKX2.1、DLX1、DLX5、SST、PV或VIP的GABA能神经元中提供转基因的选择性表达。在其他实施方案中，与非PV神经元相比，调控组件在小白蛋白(parvalbumin；PV)神经元中提供转基因的选择性表达。在一些实施方案中，非PV神经元为兴奋性神经元、多巴胺能的(dopaminergic)神经元、星形胶质细胞(astrocyte)、小神经胶质细胞(microglia)或运动神经元中的一或多者。在一些实施方案中，调控组件提供与不同GABA能神经元亚型中相同调控组件的转基因的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与不同GABA能神经元亚型中相同调控组件的转基因的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的转基因的选择性表达。
[0003]在一些实施方案中，本专利技术提供一种于细胞类型或细胞亚型中识别提供转基因的选择性表达的调控组件的方法，其包含：a)向细胞提供载体的混合物，这些载体各自包含可操作地连接于转基因的候选调控组件，其中各载体进一步包含条形码；b)自表达该转基因的复数个单细胞中分离RNA；c)通过测序单细胞中的每一者的转录组来识别这些单细胞中的每一者；d)使转录组中的条形码与候选调控组件相关联；及e)将通过各候选调控组件提供的转基因的表达量与转基因的参考表达量进行比较；从而识别在该细胞类型中提供转基因的选择性表达的候选调控组件。在一些实施方案中，调控组件选择性地增加或减少细胞类型中转基因的表达。在一些实施方案中，转基因的参考表达量通过对照调控组件提供。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的转基因的选择性表达。在一些实施方案中，转基因的参考表达量通过泛细胞(pan
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cellular)调控组件提供。在一些实施方案中，泛细胞调控组件选自由以下者组成的组：巨细胞病毒主要即刻早期启动子(cytomegalovirus major immediate
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early promoter；CMV)、鸡β
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肌动蛋白启动子(chickenβ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种识别于给定细胞类型中提供选择性表达的调控组件的方法，其包含：a.向细胞提供载体的混合物，该载体各自包含可操作地连接于转基因的候选调控组件，其中各载体进一步包含条形码；b.自表达该转基因的复数个单细胞中分离RNA；c.通过测序该单细胞中的每一者的转录组(transcriptome)来识别该单细胞中的每一者；及d.使转录组中的条形码与候选调控组件相关联，从而识别在该细胞类型中提供选择性表达的调控组件。2.根据权利要求1的方法，其中该调控组件选择性地增加该细胞类型中该转基因的表达。3.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的该转基因的选择性表达。4.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的该转基因的选择性表达。5.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的该转基因的选择性表达。6.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与不同细胞类型中相同调控组件的该转基因的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的该转基因的选择性表达。7.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与不同细胞类型中相同调控组件的该转基因的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的该转基因的选择性表达。8.根据权利要求1的方法，其中该调控组件提供与不同细胞类型中相同调控组件的该转基因的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的该转基因的选择性表达。9.根据权利要求1的方法，其中该调控组件在一种细胞类型中提供相对于至少一种其他细胞类型的该转基因的选择性表达。10.根据权利要求1的方法，其中与非PV神经元相比，该调控组件在小白蛋白(parvalbumin，PV)神经元中提供该转基因的选择性表达。11.根据权利要求10的方法，其中该非PV神经元为兴奋性神经元、多巴胺(dopaminergic)神经元、星形胶质细胞、小神经胶质细胞或运动神经元中的一或多者。12.一种识别于细胞类型中提供转基因的选择性表达的调控组件的方法，其包含：a.向细胞提供载体的混合物，该载体各自包含可操作地连接于转基因的候选调控组
件，其中各载体进一步包含条形码；b.自表达该转基因的复数个单细胞中分离RNA；c.通过测序该单细胞中的每一者的转录组来识别该单细胞中的每一者；d.使转录组中的条形码与该候选调控组件相关联；及e.将通过各候选调控组件提供的该转基因的表达量与该转基因的参考表达量进行比较；从而识别在该细胞类型中提供该转基因的选择性表达的候选调控组件。13.根据权利要求12的方法，其中该调控组件选择性地增加或减少该细胞类型中该转基因的表达。14.根据权利要求12的方法，其中该转基因的参考表达量通过对照调控组件提供。15.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的该转基因的选择性表达。16.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的该转基因的选择性表达。17.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过另一候选调控组件及/或对照调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的该转基因的选择性表达。18.根据权利要求12的方法，其中该转基因的参考表达量通过泛细胞(pan
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cellular)调控组件提供。19.根据权利要求12的方法，其中该泛细胞调控组件选自由以下者组成的组：巨细胞病毒主要即刻早期启动子(CMV)、鸡β
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肌动蛋白启动子(CBA)、CMV早期增强子/CBA启动子(CAG)、延伸因子
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1α启动子(EF1α)、猴病毒40启动子(SV40)、磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)及聚泛素C基因启动子(UBC)。20.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过泛细胞调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的该转基因的选择性表达。21.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过泛细胞调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的该转基因的选择性表达。22.根据权利要求12的方法，其中该调控组件提供与相同细胞类型中通过泛细胞调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的该转基因的选择性表达。23.根据权利要求12的方法，其中该调控组件在一种细胞类型中提供相对于至少一种其他细胞类型的该转基因的选择性表达。
24.根据权利要求12的方法，其中与非PV神经元相比，该调控组件在PV神经元中导致该转基因的选择性表达。25.根据权利要求24的方法，其中该非PV神经元为兴奋性神经元、多巴胺神经元、星形胶质细胞、小神经胶质细胞或运动神经元中的一或多者。26.一种识别选择性表达可操作地连接于调控组件的转基因的细胞类型的方法，其包含：a.向细胞提供载体的混合物，该载体各自包含可操作地连接于转基因的候选调控组件，其中各载体进一步包含条形码；b.自表达该转基因的复数个单细胞中分离RNA；c.通过测序该单细胞中的每一者的转录组来识别该单细胞中的每一者；d.使转录组中的条形码与该候选调控组件相关联；及e.将通过候选调控组件在一种细胞类型中提供的该转基因的表达量与相同候选调控组件在不同细胞类型中的表达量进行比较从而识别选择性表达该可操作地连接调控组件的转基因的细胞类型。27.根据权利要求26的方法，其中与至少一种其他细胞类型相比，该调控组件选择性地增加或减少一种细胞类型中该转基因的表达。28.根据权利要求26的方法，其中该调控组件在一种细胞类型中提供与至少一种其他细胞类型中通过该调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍或至少10倍的该转基因的选择性表达。29.根据权利要求26的方法，其中该调控组件在一种细胞类型中提供与至少一种其他细胞类型中通过该调控组件驱动的表达相比，大于或小于至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的该转基因的选择性表达。30.根据权利要求26的方法，其中该调控组件在一种细胞类型中提供与至少一种其他细胞类型中通过该调控组件驱动的表达相比，大于或小于约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍或10倍的该转基因的选择性表达。31.根据权利要求26的方法，其中与非PV神经元相比，该调控组件在PV神经元中导致该转基因的选择性表达。32.根据权利要求31的方法，其中该非PV神经元为兴奋性神经元、多巴胺神经元、星形胶质细胞、小神经胶质细胞或运动神经元中的一或多者。33.根据权利要求1至32中任一项的方法，其中该RNA选自由以下者组成的组：mRNA、长非编码RNA、反义转录物及pri
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miRNA。34.根据权利要求1至33中任一项的方法，其中该载体选自由以下者组成的组：质粒、病毒载体或黏粒。35.根据权利要求34的方法，其中该病毒载体为腺相关病毒(AAV)载体。36.根据权利要求35的方法，其中该AAV载体为AAV1、AAV8、AAV9、scAAV1、scAAV8或scAAV9。37.根据权利要求36的方法，其中该AAV载体为AAV9。
38.根据权利要求35至37中任一项的方法，其中该载体包含5'AAV反向末端重复(ITR)序列及3'AAV ITR序列。39.根据权利要求1至38中任一项的方法，其中该载体的混合物包含至少104个候选调控组件。40.根据权利要求1至39中任一项的方法，其中各候选调控组件与至少一个独特条形码相关。41.根据权利要求1至40中任一项的方法，其中该转基因包含报导基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：编码治疗公司，
类型：发明
国别省市：