一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物，属于载药体系技术领域。本发明专利技术的DNA四面体复合物是由一种兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物。所述兼并寡核苷酸具有如下序列：DTWACANNNNNDTAACA；其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。本发明专利技术的DNA四面体复合物易于被细菌摄取，可有效抑制细菌胞外多糖的形成，从而显著抑制细菌生物膜的生长。本发明专利技术的复合物可应用于降低细菌抗逆性，提高抗生素灭菌的效果；还有望应用于局部慢性感染的辅助治疗，提高抗感染疗效。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物
本专利技术属于载药体系
，具体涉及一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物。
技术介绍
细菌生物被膜(或称细菌生物膜Bacterialbiofilm，BF)，是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。生理条件下，与浮游细菌相比，BF细菌对抗生素的耐药性可提高500-5000倍，其原因在于：首先，由于生物膜环境中营养物和空间的竞争，生物膜中的细菌生长和增殖，代谢率降低。其次，EPS(胞外聚合物)基质中的蛋白质和多糖成分可以防止和延迟抗生素渗透到生物膜中，给予位于基质深处的成熟细胞更多时间形成抗性。第三，个体细菌具有抗性并产生抗生素抗性因子，从而导致整个生物膜群落的抗性；它被称为被动抗性，抗性相关基因可以通过侧向基因转移在细菌之间共享，这是一种在生物膜中不同菌株之间交换基因的机制。BF内细菌并非随意堆砌，而是相互协调，构成一个具有高度分化结构的群体。除了对抗生素的耐药性提高以外，BF相比浮游细菌适应环境的能力(抗宿主免疫能力、耐酸性、抗饥饿性等等能力等等)全面提高，还具有更高的毒力。微生物生物膜形成现在被认为是许多局部慢性感染的主要毒力因子。例如，心脏，肺组织，皮肤，口腔等。由于生物膜具有自我保护能力和强毒性，传统的治疗方法(如机械清创，抗生素，生物膜驱逐剂)无法提供足够的治疗效果，因此对抗生物膜感染的关键是抑制生物膜的形成。DNA四面体(TDNs或tFNAs)，是一种性能优异的纳米材料，无毒性、有良好的生物相容性和生物可降解性，优异的细胞膜通透性，特别是具有精准的结构可控性使其具备强大的应用潜力。当前，在生物医学领域引起广泛的重视，特别是作为一种性质优良的载体。tFNAs是由四条特别设计过的无义序列的单链DNA(ssDNA)S1、S2、S3、S4通过自组装形成的具有三维结构的DNA纳米材料，四条单链序列遵循“碱基互补配对原则”，合成方法简单，产率高。目前已发现单纯的tFNAs结构能够穿过细胞膜而进入活细胞，并具有促进干细胞增殖，维持细胞形态的作用，其可作为一种载体，且无细胞毒性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种有效抑制变异链球菌细菌生物膜生长的DNA四面体复合物。本专利技术中，“生物膜”与“BF”、“细菌生物膜”的概念等同。本专利技术中，“兼并寡核苷酸”指由具备相似碱基序列的不同寡核苷酸组成的混合物；所述的相似碱基序列可以用一个通式表示，该通式为“兼并序列”。本专利技术的技术方案包括：一种兼并寡核苷酸，其序列为DTWACANNNNNDTAACA；其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。如前述的兼并寡核苷酸，所述寡核苷酸中序列不同的寡核苷酸分子等摩尔比混合。一种DNA四面体复合物，它是将前述的兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物。如前述的DNA四面体复合物，所述DNA四面体由序列如SEQIDNO.1～4所述的DNA单链通过碱基互补配对形成。如前述的DNA四面体复合物，所述兼并寡核苷酸通过共价键连接在序列如SEQIDNO.2所示的DNA单链上。前述的寡核苷酸在制备抑制细菌生物膜生长的药物中的用途；所述药物是以前述兼并寡核苷酸为活性成分，加上能将寡核苷酸运输至细菌细胞内的载体，制备而成。如前述的用途，所述细菌为变异链球菌。前述DNA四面体复合物在制备抑制细菌生物膜生长的药物中的用途。进一步的，所述细菌为变异链球菌。本专利技术还提供了一种抑制细菌生物膜生长的药物，它的活性成分是前述DNA四面体复合物。进一步的，所述细菌是变异链球菌。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术的寡核苷酸具有靶向多个基因的能力，使用DNA四面体运送其进入细菌体内后，能够表现出明显的抑制胞外多糖合成相关的多个基因GtfB、GtfC、GtFD，GbpB和Ftf的能力。2)本专利技术的DNA四面体复合物容易被细菌摄取。实验证明，本专利技术的DNA四面体复合物(ASOs-tFNAs)，相比单独的寡核苷酸(ASOs)或DNA四面体(tFNAs)进入菌体能力都有显著提高；这为寡核苷酸发挥抑制生物膜作用奠定了坚实的基础。3)本专利技术的DNA四面体复合物能够有效抑制细菌生物膜的形成。值得注意的是，本专利技术的ASOs-tFNAs中，tFNAs能提升对ASOs的抑制功效，产生协同增效作用：实验表明，tFNAs和ASOs对生物膜形成的抑制作用之和远远低于ASOs-tFNAs。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为本专利技术的DNA四面体复合物(ASOs-tFNAs)的构建流程。图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。图3为原子力显微镜验证的tFNAs，ASOs-tFNAs粒径，形态大小结果图。图4为透射电镜验证ASOs-tFNAs的形态结果图。图5为tFNAs的粒径结果图。图6为ASOs-tFNAs粒径结果图。图7为tFNA，ASOs-tFNA粒径，电位测试统计学分析结果。图8为流式细胞术检验变异链球菌对ASOs-tFNAs的摄取结果图。图9为浮游细菌为加入不同浓度tFNAs，ASOs-tFNAs后的生长曲线图。图10不同浓度tFNAs，ASOs-tFNAs在处理24，48h后的生物膜结晶紫染色图和统计结果。图11为不同浓度不同浓度tFNAs，ASOs，ASOs-tFNAs处理24h的3D层扫结果。图12为750nMtFNAs，ASOs，ASOs-tFNAs处理24后的生物膜扫描电镜图。图13为q-PCR检测寡核苷酸所有目标基因表达的变化结果。具体实施方式实施例1本专利技术的DNA四面体复合物的合成1.制备方法每条ssDNA单链(S1、ASOs-S2、S3、S4)以相同摩尔浓度浓度加入含有TMbuffer(10mMTris-HCl，50mMMgCl2，pH8.0)的EP管中，涡旋混匀，离心，然后置于PCR仪内，将温度迅速升高到95℃维持10min，再快速降温到4℃维持20min，合成ASOs-tFNAs，浓度约为1000nM，其构建过程如图1所示。相关序列如表1所示，S1～S4是组成DNA四面体最基本的ssDNA，ASOs即为本专利技术复合物中具有抑制BF活力的反义寡核苷酸的兼并序列，ASOs通过磷酸二酯键与S1～S4中任一单链相连(本实施例中是与S2相连，形成ASOs-S2)，即可被固定于最终合成的DNA四面体上。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兼并寡核苷酸，其特征在于：它具有如下序列：/nDTWACANNNNNDTAACA；/n其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。/n

【技术特征摘要】
1.一种兼并寡核苷酸，其特征在于：它具有如下序列：
DTWACANNNNNDTAACA；
其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。


2.如权利要求1所述的兼并寡核苷酸，其特征在于：所述兼并寡核苷酸中序列不同的寡核苷酸等摩尔比混合。


3.一种DNA四面体复合物，其特征在于：它是将权利要求1或2所述的兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物。


4.如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述DNA四面体由序列如SEQIDNO.1～4所述的DNA单链通过碱基互补配对形成。


5.如权利要求4所述的复合物，其特征在于：所述兼并寡核苷酸通过共价键连接在序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：林云锋，张雨欣，谢雪萍，马文娟，战雨汐，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51