家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于家蚕转基因技术领域，具体涉及一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用，所述启动子的核苷酸基因如SEQ ID NO：16所示，该启动子可以驱动外源基因在家蚕中经家蚕微粒子虫诱导下表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程进行家蚕品种改良，特别是家蚕抗微粒子病的品种培育，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用
本专利技术属于家蚕转基因
，具体涉及一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子及其应用。
技术介绍
蚕丝业是我国的传统优势产业，至今仍主导国际市场，是千万农户重要的经济收入来源。家蚕微粒子病(Pébrine)是危害蚕业安全生产的头号疫病，其根本原因在于该病的病原—家蚕微粒子虫(Nosemabombycis)可经卵垂直传播造成蚕种带毒。当前，我国每年因微粒子病而带来的直接经济损失即达上亿元，全国主要蚕种场用于防控该病的花费占蚕种生成总支出的一半。然而，目前生产上尚未发现对该病有抗性的家蚕材料。随着家蚕转基因技术的突破和完善，转基因技术已成为家蚕抗性材料选育的强有力的工具。但是，目前通过转基因家蚕育种方面还是利用组成型表达的启动子。利用组成型启动子一方面外源基因的表达效率会降低，另一方面会对家蚕本身带来负担。目前鲜有关于家蚕微粒子虫诱导型启动子的报道。因此，开发家蚕微粒子虫诱导型启动子对在构建家蚕微粒子虫抗性育种素材中减少外源基因组成性表达的负荷，提高转基因家蚕的抗性以及开发新的微粒子虫抗性系统具有重大意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，目的之二在于提供一种重组表达载体，目的之三在于提供一种重组表达载体的构建方法，目的之四在于提供一种重组细胞，目的之五在于提供一种外源蛋白，目的之六在于提供一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子在培育抗微粒子虫家蚕中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。2、一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子。3、一种重组表达载体的构建方法，所述方法为，根据所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子的核苷酸序列，设计含有表达载体酶切位点的上、下游引物，以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得含所述启动子的目的片段，将所述目的片段连接在表达载体上，得到重组表达载体。作为优选的技术方案之一，所述表达载体为pSLfa1180fa载体。作为优选的技术方案之一，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：17所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：18所示。4、一种重组细胞，所述重组细胞是由所述重组表达载体转化至受体细胞而得。5、一种外源蛋白，所述外源蛋白是由所述重组细胞所表达。6、所述家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子在培育抗微粒子虫家蚕中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的BmPUGT3启动子可以驱动外源基因在家蚕中经家蚕微粒子虫诱导下表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程进行家蚕品种改良，特别是用于家蚕抗微粒子病的品种培育，比如诱导表达内外源致死基因以及诱导型的基因编辑系统，具有良好的应用前景。附图说明图1为RT-PCR检测结果图，N3-N48分别代表家蚕微粒子虫感染后3h、6h、12h、24h及48h的RT-PCR检测结果，C3-C48为其清水对照组；图2为未感染家蚕微粒子虫时家蚕各组织BmPUGT3的转录表达检测；图3为BmPUGT3启动子预测，下划线加粗的碱基为预测的转录起始位点，下划线上大写加粗的ATG为翻译起始位点，灰框序列为5’UTR区域；图4为通过RT-PCR检测BmPUGT3的转录起始位点，1～6分别是BmPUGT3-5'-F1/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F2/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F3/BmPUGT3-R、BmPUGT3-5'-F4/BmPUGT3-R、BmPUGT3-F/BmPUGT3-5'-R及BmA3-F/BmA3-R引物对的扩增结果；图5为BmN-SWU1细胞转染pSL[PPUGT3-mCherry-SV40]表达载体后的红色荧光的发光情况结果图，A为转染表达载体后添加家蚕微粒子虫诱导的荧光观察结果图，B为转染表达载体添加家蚕微粒子虫诱导的白光观察结果图，C为转染表达载体后添加PBS作对照的荧光观察结果图，D为转染表达载体添加PBS作对照的白光观察结果图。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等编著)中所述的条件，或者按照制造商所建议的条件。实施例1获取家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3基因序列根据家蚕基因组数据库SilkDB(https://silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)及kaikobase(https://kaikobase.dna.affrc.go.jp/)，获得BmPUGT3(BGIBMGA010295)基因的CDS序列(SEQIDNO:1)，根据BmPUGT3的基因序列设计该基因的检测引物BmPUGT3-F及BmPUGT3-R，家蚕Actin3基因为内参，引物为BmA3-F和BmA3-R。BmPUGT3-F：5'-atggagattggattaaaagtag-3'(SEQIDNO：2)BmPUGT3-R：5'-ttacttttgattggacaaaacc-3'(SEQIDNO：3)BmA3-F：5'-atggtgcgctcctccaagaacg-3'(SEQIDNO：4)BmA3-R：5'-ctacaggaacaggtggtggcgg-3'(SEQIDNO：5)将正常家蚕大造品种以人工饲料于标准环境中饲养(温度：25℃，湿度：80％)，5龄起蚕，一部分添食家蚕微粒子虫，另一部分添食清水作为对照。在添食3h，6h，12h，24h，48h后分别取其中肠，用RNA提取试剂盒(R6934，OMEGA)提取RNA，然后用反转录试剂盒(A5001，Promega)将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，BmPUGT3-F及BmPUGT3-R为引物，用rTaq酶(R004,Takara)进行PCR扩增，BmA3-F和BmA3-R引物对为对照，扩增条件为：对PCR产物进行琼脂糖凝胶检测。结果如图1、图2所示，BmPUGT3仅在感染24及48小时检测到其转录，而未感染的情况下没有检测到该基因的转录；并且在正常家蚕的各个组织中均未检测到该基因的转录。由此证明BmPUGT3确实可以被微粒子虫诱导表达。取上述感染48小时家蚕的中肠，提取总RNA，以3'raceoligodt为引物用反转录试剂盒(A5001,Promega)将RNA反转为cDNA。以该cDNA为模板，BmPUGT3-F及GenRacer3'primer为上下游引物，用Q5高保真本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种家蚕微粒子虫诱导表达基因BmPUGT3的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。


2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1中所述的启动子。


3.权利要求2所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法为，根据权利要求1所述的启动子的核苷酸序列，设计含有表达载体酶切位点的上、下游引物，以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得含所述启动子的目的片段，将所述目的片段连接在表达载体上，得到重组表达载体。


4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春峰，于滨，潘国庆，周泽扬，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50