一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺制造技术

本发明专利技术涉及动物疫苗生产技术领域，特别公开了一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺。该发酵培养工艺，其特征在于：将血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌冻干种子溶解后涂板，洗板后接种液体TSB培养基制备二级种子；将二级种子接种至含无血清培养基的发酵罐中，发酵过程中补料两次，当发酵液OD

【技术实现步骤摘要】
一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺


[0001]本专利技术涉及动物疫苗生产
，特别涉及一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺。

技术介绍

[0002]猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染性呼吸道疾病。能引起各个年龄的猪急性和慢性感染，是一种致死性和高度接触性的传染病。该病以急性出血性纤维素性胸膜炎和出血性肺炎为主要特征，急性死亡率可达80%以上。猪传染性胸膜肺炎造成的经济损失主要表现为急性暴发时引起的死亡、生产及治疗成本提高、增长率及出栏重降低、胴体品质下降。另外，由于胸膜肺炎放线杆菌感染造成猪只的肺部损伤，为其他病原的感染创造了条件。根据菌体表面荚膜和脂多糖抗原性的差异，可将其分为15个血清型，其中1型和5型又可划分A和B两个亚型。在我国流行的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10，而1、2、4、5、7型为我国流行的优势血清型。随着抗生素的广泛使用，胸膜肺炎放线杆菌的耐药性逐渐增强，曾有报道称从我国胸膜肺炎放线杆菌地方分离株中分离到多抗性质粒。随着国家对食品安全的高度关注，我国也出台相关禁抗限抗政策，因此疫苗免疫接种成为预防和控制疾病最为主要的措施。目前商品化的疫苗有2种，即灭活疫苗和亚单位疫苗。国内批准使用的有3种，即猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗（1、2、7型）、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌二价蜂胶灭活疫苗（1、7型）、猪传染性胸膜肺炎二价灭活疫苗（1、7型）；国内外批准的猪胸膜肺炎亚单位疫苗是荷兰英特威公司利用胸膜炎放线杆菌分泌的毒素经脱毒与免疫保护性蛋白混合制成的四价苗。
[0003]近年来，胸膜肺炎放线杆菌血清5型的流行有上升趋势且毒力较强，常导致现有灭活疫苗及亚单位疫苗保护效果差。目前国内关于血清 5 型 APP 的报道很少，该菌株的分离及大规模培养工艺的优化可为血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌相关疫苗的开发提供技术支撑，进而为防治 APP 流行奠定基础。
[0004]目前对于猪胸膜肺炎放线杆菌的培养多采用有血清的高密度发酵培养，培养基及血清的残留，常常造成疫苗安全性降低；同时，常规方法发酵培养活菌数在5.0
×
109‑
9.0
×
109CFU/ml之间，随着猪胸膜肺炎放线杆菌流行血清型的增多，多价疫苗的研制势在必行。提高发酵的抗原含量能够有效减轻生产多价疫苗的压力，降低甚至无血清发酵培养，可以大大提高多价疫苗的安全性。目前也缺少针对血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清发酵培养的生产工艺研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种抗原含量高、生产成本低、适于规模化生产的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案实现的：
一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺，其特征在于：将血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌冻干种子溶解后涂板，洗板后接种液体TSB培养基制备二级种子；将二级种子按照2.5%（V/V）量接种至含无血清培养基的发酵罐中，发酵过程中补料两次，每次补加0.5%
‑
2%葡萄糖（G/V，50%）和1%
‑
3%谷氨酸钠（G/V，10%），当发酵液OD
600nm
≥2.5时停止发酵，收获菌液；将菌液通过浓缩、洗滤，得到血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌高密度发酵抗原。
[0007]本专利技术对血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵工艺进行研究，通过添加血清替代物，优化不了方法，进行工业放大生产研究，提高了抗原含量，降低生产成本，获得了免疫原性好的半成品，满足规模化生产需求。
[0008]本专利技术的更优方案如下：二级种子的制备过程为：（1）取冻干种子用含5%成牛血清和0.2%NAD的TSA平板活化12
‑
18h，至长出单菌落；挑取单菌落接种至含5%成牛血清和0.2%NAD的TSA琼脂斜面，培养12
‑
16h，作为一级种子；（2）用TSB液体洗涤一级种子斜面，接种于含5%成牛血清和0.2%NAD的TSB液体培养基中，于37℃，120rpm摇床震荡培养4
‑
6h，培养至OD
600
值达到0.4
‑
0.6，作为二级种子。
[0009]所述无血清发酵培养基由A和B两部分组成；A部分为酪蛋白胨5
‑
15g/L，酵母浸粉2
‑
8g/L、NAD 0.5
‑
3g/L、葡萄糖8
‑
15g/L、K2HPO4·
3H2O 1
‑
3g/L、NaCl 1
‑
5g/L，121℃灭菌30min；B部分为马血清白蛋白冻干粉1.0
‑
10.0g/L，溶解过滤除菌。
[0010]进一步优选的，所述无血清发酵培养基中，A部分为酪蛋白胨6
‑
10g/L,酵母浸粉3
‑
6g/L、NAD 1
‑
2g/L、葡萄糖8
‑
12g/L、K2HPO4·
3H2O 1
‑
2g/L、NaCl 1
‑
3g/L；B部分马血清白蛋白冻干粉为3
‑
8g/L。
[0011]所述发酵过程中各项参数为：温度37
±
0.5℃，pH7.2
±
0.1，搅拌速度160rpm，罐内压力0.03
‑
0.05Mpa，控制溶氧40%
‑
60%。
[0012]所述发酵过程中，在发酵菌液OD
600
=1.0
±
0.1、1.6
±
0.1时，补加1%葡萄糖（G/V，50%）和2%谷氨酸钠（G/V，10%）溶液，流速控制在20
‑
30ml/min。
[0013]进一步优选的，所述菌液通过中空纤维6
‑
8倍浓缩、PBS溶液洗滤两次，得到产品。
[0014]进一步优选的，所述发酵菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型SC菌株。
[0015]本专利技术工艺操作简单，培养时间段，制备的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌半成品不含血清，进一步制备的灭活疫苗可有效预防血清5型猪传染性胸膜肺炎疾病的发生。
附图说明
[0016]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0017]图1为血清5型胸膜肺炎防线杆菌SC菌株形态鉴定结果示意图；图2为猪胸膜肺炎放线杆菌种属PCR鉴定结果（450bp）示意图；图3为血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌血清型PCR鉴定结果示意图；图4为实施例1发酵活菌培养曲线图；图5为实施例2发酵活菌培养曲线图；图6为高密度发酵抗原制备疫苗对仔猪的攻毒保护结果示意图；
图7为高密度发酵抗原制备疫苗对SPF小鼠的攻毒保护结果示意图。
[0018]图1中，A为分离平板形态，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌无血清高密度发酵培养工艺，其特征在于：将血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌冻干种子溶解后涂板，洗板后接种液体TSB培养基制备二级种子；将二级种子按照2.5%（V/V）量接种至含无血清培养基的发酵罐中，发酵过程中补料两次，每次补加0.5%
‑
2%葡萄糖（G/V，50%）和1%
‑
3%谷氨酸钠（G/V，10%），当发酵液OD
600nm
≥2.5时停止发酵，收获菌液；将菌液浓缩、洗滤，得到血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌高密度发酵抗原。2.如权利要求1所述的发酵培养工艺，其特征在于：二级种子的制备过程为：（1）取冻干种子用含5%成牛血清和0.2%NAD的TSA平板活化12
‑
18h，至长出单菌落；挑取单菌落接种至含5%成牛血清和0.2%NAD的TSA琼脂斜面，培养12
‑
16h，作为一级种子；（2）用TSB液体洗涤一级种子斜面，接种于含5%成牛血清和0.2%NAD的TSB液体培养基中，于37℃，120rpm摇床震荡培养4
‑
6h，培养至OD
600
值达到0.4
‑
0.6，作为二级种子。3.如权利要求1所述的发酵培养工艺，其特征在于：所述无血清发酵培养基由A和B两部分组成；A部分为酪蛋白胨5
‑
15g/L，酵母浸粉2
‑
8g/L、NAD 0.5
‑
3g/L、葡萄糖8
‑
15g/L、K2HPO4·
3H2O 1
‑
3 g/L、NaCl 1

【专利技术属性】
技术研发人员：耿兴良，杨灵芝，朱杰，吴洪才，李香云，杨平，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：