I群4型禽腺病毒fiber-2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程疫苗技术领域，特别公开了一种I群4型禽腺病毒fiber

【技术实现步骤摘要】
I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程疫苗
，特别涉及一种I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）属于禽腺病毒科禽腺病毒属，禽腺病毒分3个群，I群、Ⅱ群和Ⅲ群。I群禽腺病毒共12个血清型，临床上主要引起包涵体肝炎、心包积液和肌胃糜烂等。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒（Hemorrhagic enteritis virus，HEV）、大理石脾病毒（Marble spleen disease virus，MSDV）和鸡大脾病毒（Avian adenovirus group II splenomegaly，AASV）。Ⅲ群禽腺病毒主要是禽减蛋综合征病毒（Egg drop syn
‑
drom virus，EDSV）。FAdV
‑
4型主要引起心包积水肝炎综合征，给国内养鸡业带来严重的经济损失。
[0003]禽腺病毒是一种无囊膜的直径粒子为70
‑
90nm的球形颗粒，二十面体对称结构。FAdV的主要结构蛋白有：五邻体（Penton）、六邻体（Hexon）和纤维突起（Fiber）。其中二十面体的12个顶角颗粒为五邻体，240个非顶角颗粒为六邻体以及位于五邻体上的纤维突起，FAdV
‑
4具有2条纤维蛋白。
[0004]亚单位疫苗作为一种新型基因工程疫苗，在疾病防控中具有简便、低廉和高效等特点。针对FAdV
‑
4的亚单位疫苗研发中，fiber
‑
2基因由于具有良好的免疫原性，作为疫苗开发的重点。但是fiber
‑
2蛋白由于自身蛋白结构原因，表达后多为包涵体表达，而通过非编码基因调控表达获得针对fiber
‑
2基因的可溶性表达蛋白，对于疫苗的商品化开发和疾病的防控具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、安全有效的I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原及其制备基因工程亚单位疫苗的方法和应用。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原，其特征在于：所述蛋白抗原对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]实现fiber
‑
2蛋白泉城表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0008]采用上述I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原制备制备基因工程亚单位疫苗的方法，包括如下步骤：（1）扩增序列fiber
‑
2蛋白编码基因SEQ ID NO.1；（2）将扩增后基因克隆到表达载体pET
‑
28a获得重组质粒；（3）将重组质粒转化至表达感受态细胞BL21(DE3)中，获得重组工程菌；（4）用IPTG诱导重组工程菌进行表达、纯化、脱毒后获得fiber
‑
2蛋白，进一步的，
该禽腺病毒fiber
‑
2蛋白含量AGP效价≥1:8；（5）将fiber
‑
2蛋白用PBS稀释，并加入tween
‑
80，制成水相，使用白油、Span
‑
80、硬脂酸铝混合制成油相，将水相、油相混合乳化，得到亚单位疫苗。
[0009]本专利技术在禽腺病毒FAdV
‑
4的fiber
‑
2基因前面添加非编码基因，并将其克隆到原核表达载体pET
‑
28a，转化至大肠杆菌构建工程菌，诱导工程菌表达获得可溶性fiber
‑
2蛋白。其中禽腺病毒fiber
‑
2抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2 ，其编码的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，并且通过非编码基因调控获得高表达量的可溶性蛋白。
[0010]本专利技术的更优技术方案为：步骤（1）中，设计并合成引物序列：fiber2
‑
f：5
’‑
CCCGAATTCACGATCGCAGCGATGCTCGGGGACCCTATAAGAAGTC
‑3’
，fiber2
‑
r：5
’‑
CTAAAGCTTTTACGAGAGGCAGGCCTCTGGTCAG
ꢀ‑3’
；以分离的腺病毒核酸作为模板，用fiber2
‑
f和fiber2
‑
r引物扩增fiber
‑
2基因，并将扩增产物克隆到pMD
‑
18T载体上，获得pMD
‑
18T
‑
fiber2。
[0011]进一步优选的，步骤（2）中，将pMD
‑
18T
‑
fiber2质粒和pET
‑
28a均用EcoR1和HindⅢ进行双酶切，之后将酶切体系放置于37℃水浴中1h，进行回收目的片段和载体；酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别回收pMD
‑
18T
‑
fiber2质粒中1440bp大小的目的片段和pET
‑
28a治理中5900bp大小的片段；将回收的目的片段和质粒按照T4
‑
DNA连接没反应进行连接，连接体系在25℃下反应30min，待反应完成后进行转化。
[0012]更进一步优选的，步骤（3）中，将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒测序分析，序列正确的质粒命名为pET
‑
28a
‑
fiber
‑
2；将pET28a
‑
fiber
‑
2质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞，挑取单个菌落于50μg/ml卡那霉素的培养基中过夜培养，即为表达质粒菌液。
[0013]步骤（4）中，将重组工程菌按照1%的体积比接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃和220rpm条件下摇菌至OD600在0.6
‑
0.8之间，加入0.5mM的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷，于28℃条件下振荡诱导过夜，培养结束后，离心收集菌体；在离心管中加入1.0%的曲拉通X
‑
114，涡旋振荡混匀后，放置冷藏条件下过夜，然后放置37℃水浴，并且离心获得脱毒后上清，如此反复多次脱毒，得到fiber
‑
2蛋白。
[0014]步骤（5）中，将fiber
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原，其特征在于：所述蛋白抗原对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原，其特征在于：实现fiber
‑
2蛋白泉城表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。3.采用如权利要求1所述的I群4型禽腺病毒fiber
‑
2蛋白抗原制备制备基因工程亚单位疫苗的方法，其特征为，包括如下步骤：（1）扩增序列fiber
‑
2蛋白编码基因SEQ ID NO.1；（2）将扩增后基因克隆到表达载体pET
‑
28a获得重组质粒；（3）将重组质粒转化至表达感受态细胞BL21(DE3)中，获得重组工程菌；（4）用IPTG诱导重组工程菌进行表达、纯化、脱毒后获得fiber
‑
2蛋白；（5）将fiber
‑
2蛋白用PBS稀释，并加入tween
‑
80，制成水相，使用白油、Span
‑
80、硬脂酸铝混合制成油相，将水相、油相混合乳化，得到亚单位疫苗。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，设计并合成引物序列：fiber2
‑
f：5
’‑
CCCGAATTCACGATCGCAGCGATGCTCGGGGACCCTATAAGAAGTC
‑3’
， fiber2
‑
r：5
’‑
CTAAAGCTTTTACGAGAGGCAGGCCTCTGGTCAG
ꢀ‑3’
；以分离的腺病毒核酸作为模板，用fiber2
‑
f和fiber2
‑
r引物扩增fiber
‑
2基因，并将扩增产物克隆到pMD
‑
18T载体上，获得pMD
‑
18T
‑
fiber2。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将pMD
‑
18T
‑
fiber2质粒和pET
‑
28a均用EcoR1和HindⅢ进行双酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱杰，王楠，杨灵芝，王慧，李香云，王成举，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：