真核重组蛋白在试剂盒中的应用、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种真核重组蛋白在试剂盒中的应用、试剂盒及其应用。将真核重组Fiber

【技术实现步骤摘要】
蛋白和所述真核重组Fiber
‑
2蛋白。
[0010]上述技术方案中，重组杆状病毒rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1的构建及鉴定参见申请公布号为CN111518777A(一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F1的重组杆状病毒的构建方法)的中国专利的实施例。重组杆状病毒rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
2的构建及鉴定参见申请公布号为CN111534547A(一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法)的中国专利的实施例。
[0011]具体地，所述感染时间为72～120h，所述破碎为40～50Hz、间隔8～10s进行超声破碎，以便于后续纯化操作的进行。
[0012]具体地，所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白包被于所述酶标板上。
[0013]本专利技术第二方面提供一种用于检测血清4型禽腺病毒Fiber蛋白抗体的试剂盒，该试剂盒包括包被有真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白的酶标板，所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白是将重组杆状病毒rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1载体、rBacmid
‑
>FAdV
‑4‑
Fiber
‑
2载体分别感染Sf9细胞，收集细胞经重悬、破碎、离心、纯化后得到。
[0014]进一步地，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、HRP标记的兔抗鸡二抗免疫血清、样品稀释液、显色液及洗涤液。
[0015]具体地，所述阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，所述阴性对照为SPF鸡血清。
[0016]具体地，所述样品稀释液为含有0.05～0.1％Tween
‑
20的PBS，所述显色液为TMB显色液，所述洗涤液为含有0.05～0.1％Tween
‑
20的PBS。
[0017]本专利技术第三方面提供一种真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白、上述的试剂盒在检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA方法中的应用，所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白由Sf9昆虫表达系统表达获得。
[0018]通过上述技术方案，本专利技术实现了以下有益效果：
[0019]本专利技术将表达Fiber
‑
1、Fiber
‑
2重组蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞，并以镍柱亲和层析法纯化感染细胞裂解液上清中的Fiber
‑
1、Fiber
‑
2重组蛋白，将纯化的重组蛋白分别作为包被抗原组装检测FAdV
‑
4抗体的间接ELISA试剂盒。检测结果显示，该检测FAdV
‑
4抗体的间接ELISA试剂盒具有良好的FAdV
‑
4特异性、敏感性，能够特异地、有效地检测出感染FAdV
‑
4或免疫FAdV
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4疫苗的鸡群中抗FAdV
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4抗体，在FAdV
‑
4病毒流行病学调查中具有良好的应用价值，可用于FAdV
‑
4感染及免疫状况流行病学调查。
附图说明
[0020]图1是Fiber
‑
1纯化蛋白的SDS
‑
PAGE(A)和Western blot鉴定(B)结果；
[0021]图中泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化后的Fiber
‑
1蛋白；
[0022]图2是Fiber
‑
2纯化蛋白的SDS
‑
PAGE(A)和Western blot鉴定(B)结果；
[0023]图中泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化后的Fiber
‑
2蛋白；
[0024]图3是基于Fiber
‑
1(A)和Fiber
‑
2(B)蛋白的间接ELISA试剂盒特异性检测结果；
[0025]图4是基于Fiber
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1和Fiber
‑
2蛋白的间接ELISA试剂盒对免疫鸡群、攻毒鸡群血清
及SPF鸡群的抗体水平检测结果。
具体实施方式
[0026]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0027]实施例1检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒的制备
[0028]S1、构建杆状病毒表达载体：
[0029]参见中国专利CN111518777A(说明书第[0035]‑
[0052]段)的实施例构建及鉴定重组杆状病毒rBacmid
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FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1(说明书第[0035]‑
[0052]段)，参见中国专利CN111534547A的实施例构建及鉴定重组杆状病毒rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
2。
[0030]S2、重组杆状病毒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：
[0031]将重组杆状病毒rBacmid
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FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1、rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1感染Sf9细胞，96h之后收集细胞用PBS重悬后40Hz、间隔8s进行破碎，破碎完成后高速离心分离上清，再经His标签亲和层析柱纯化后得到重组Fiber
‑
1、Fiber
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2蛋白。
[0032]利用SDS
‑
PAGE分析蛋白纯化效果，可见纯化产物纯度较佳，无杂带产生，大小分别为50和70kDa(参见图1和图2)。之后利用Western
‑
blot(蛋白质印迹法)分析纯化产物与阳性血清的反应性，结果表明，表达的Fiber
‑
1、Fiber
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2蛋白与阳性血清均有良好的反应性。
[0033]S3、试剂盒的组装：
[0034]该试剂盒成分包括包被有重组Fiber
‑
1蛋白或Fiber
‑
2蛋白的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.真核重组Fiber
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1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白在制备用于检测Fiber蛋白抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白由Sf9昆虫表达系统表达获得。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达是将重组杆状病毒rBacmid
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FAdV
‑4‑
Fiber
‑
1、rBacmid
‑
FAdV
‑4‑
Fiber
‑
2分别感染Sf9细胞，收集细胞经重悬、破碎、离心、纯化后得到所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和所述真核重组Fiber
‑
2蛋白。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述感染时间为72～120h，所述破碎为40～50Hz、间隔8～10s进行超声破碎。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括酶标板，所述真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白包被于所述酶标板上。5.一种用于检测血清4型禽腺病毒Fiber蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括包被有真核重组Fiber
‑
1蛋白和/或真核重组Fiber
‑
2蛋白的酶标板，所述真核重...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，隆玉兰，谢松桦，张建军，张伟，谢泉，万志敏，李拓凡，王伟康，
申请(专利权)人：国药集团扬州威克生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：