支原体含量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种支原体含量的检测方法，其包括如下步骤：(1)将支原体抗原液离心重悬后，用BCA法检测重悬后支原体抗原液中支原体菌体蛋白浓度；(2)根据支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系计算得到步骤(1)中的支原体菌体蛋白浓度对应的支原体培养液变色单位。本发明专利技术通过检测支原体的菌体蛋白浓度可推算出支原体的总含量，检测精确度高，与实测值的误差范围基本在2％以内；该方法仅需要普通的BCA试剂盒，价格便宜，稳定可靠；对检测人员而言，只需会常规操作，会按BCA方法测定蛋白含量即可，技术要求低；样品预处理仅需10min左右，BCA测定蛋白含量仅需20～30min，相对于传统的CCU计数法和荧光定量法，时间大大缩短。大缩短。大缩短。

【技术实现步骤摘要】
支原体含量的检测方法


[0001]本专利技术属涉及生物检测方法，具体地，涉及一种支原体含量的检测方法。

技术介绍

[0002]支原体，也称霉形体，是一类大小介于细菌和病毒之间的微生物，其没有细胞壁，能够自我复制，独特的性质使其获得了单独的分类命名。其中能够引起鸡发病的支原体主要有鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)。MG和MS广泛存在于鸡场中，有的隐性感染，有的轻微发病，死亡率低，容易被忽视，但与其他病原如禽流感、新城疫、传支、法氏囊等病毒或者感染，会造成鸡场严重发病、影响生产水平，给鸡场带来重大损失。
[0003]目前，疫苗接种是预防控制支原体感染的关键措施，在疫苗研制过程中，抗原含量是重要的质量控制指标，与疫苗的实际效力密切相关。现行《中国兽药典》关于禽支原体(MS和MG)的含量通常采用标准的颜色变化单位(CCU)计数法，但这种方法检测的是培养收获时活的支原体的量，因此只适合于活疫苗产品的质量评价，不适合用于灭活疫苗生产及成品疫苗的有效抗原含量检测，同时该方法测定周期长，还会受到检测血清、检测容器、平行数测定、采样时间等影响。例如，在实际发酵过程中难以把控培养的高峰期；且部分死亡的支原体，虽然菌体死亡，但菌体蛋白仍在，具有免疫作用。错过高峰期的支原体以CCU评价难以真实评价支原体抗原的免疫原性。
[0004]当然还有采用荧光定量方法对培养液中MS和MG的DNA进行定量检验的，这种方法相对较快，约2～3h可以出荧光定量结果(提取45分装，荧光定量需要2h)，通过计算获知培养液中支原体的的核酸含量，估算支原体的CCU；这种方法因采用荧光定量方法，涉及的仪器成本很高、技术人员专业能力更高；使用的耗材成本也很高。难以在实际生产过程中展开。且荧光定量仅仅是定量DNA，而DNA复制和菌体蛋白表达通畅存在延迟，以定量DNA方式评价支原体含量会高估支原体的抗原含量。

技术实现思路

[0005]针对上述支原体检测方法时间长、成本高、专业度要求高等问题，本专利技术提供了一种支原体含量的检测方法，该检测方法通过检测支原体培养液中比较稳定的支原体蛋白的含量来换算为CCU含量，检测精确度高、成本低、时间短、技术要求低。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供一种支原体含量的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
[0007](1)将支原体抗原液离心重悬后，用BCA法检测重悬后支原体抗原液中支原体菌体蛋白浓度；
[0008](2)根据支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系计算得到步骤(1)中的支原体菌体蛋白浓度对应的支原体培养液变色单位。
[0009]支原体的免疫保护作用，主要是在支原体表面的一类结构蛋白，在支原体入侵机体时这类蛋白是主要的抗原识别位点，这类结构蛋白表达量通常比较稳定。另外，支原体细
胞内的蛋白主要为协助蛋白表达和核酸复制一类的必须功能蛋白，它们和结构蛋白一样表达量稳定。
[0010]因支原体结构蛋白表达量稳定，所以菌体蛋白与支原体数量活菌数之间存在一定相关性，本专利技术通过检测支原体的菌体蛋白浓度可推算出支原体的总含量(CCU50)，检测精确度高，与实测值的误差范围基本在2％以内，计算出的CCU50不仅包括活菌数，死亡的菌体蛋仍可计算在内；该方法仅需要普通的BCA试剂盒，价格便宜，稳定可靠；对检测人员而言，只需会常规操作，会按BCA方法测定蛋白含量即可，技术要求低；样品预处理仅需10min左右，BCA测定蛋白含量仅需20～30min，相对于传统的CCU计数法(7天左右)和荧光定量法(3h左右)，时间大大缩短。
[0011]优选地，所述离心的条件为：12000～15000rpm，2～8℃，3～5min。
[0012]优选地，步骤(2)中，支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系的获得方法为：取支原体培养高峰期前(死亡的菌体蛋白仍然存在，但并没有CCU50，没有活性)发酵不同时间点的抗原液，离心重悬后用BCA法检测其中菌体蛋白含量(mg/ml)，换算出培养液中MS菌体蛋白浓度，同时测定上述取样过程中同时间点的支原体培养液变色单位，计算支原体培养液变色单位(CCU50)和菌体蛋白浓度(mg/ml)之间的关系。
[0013]作为本专利技术的一个优选实施方式，支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系如式(1)所示：
[0014]CCU
50
＝Log(100000000
×
2.718282^12.969
×
X，10)
ꢀꢀꢀ
(1)，
[0015]X表示滑支原体抗原液离心后支原体菌体蛋白浓度，mg/ml。
[0016]通过上述技术方案，本专利技术实现了以下有益效果：
[0017]本专利技术通过检测支原体的菌体蛋白浓度可推算出支原体的总含量(CCU50)，检测精确度高，与实测值的误差范围基本在2％以内，计算出的CCU50不仅包括活菌数，死亡的菌体蛋仍可计算在内；该方法仅需要普通的BCA试剂盒，价格便宜，稳定可靠；对检测人员而言，只需会常规操作，会按BCA方法测定蛋白含量即可，技术要求低；样品预处理仅需10min左右，BCA测定蛋白含量仅需20～30min，相对于传统的CCU计数法(7天左右)和荧光定量法(3h左右)，时间大大缩短。
附图说明
[0018]图1是本专利技术实施例中由BCA试剂盒建立的标准曲线；
[0019]图2是菌体蛋白浓度和CCU
50
之间相关性曲线。
具体实施方式
[0020]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0021]以下实施例中，以鸡滑液囊支原体HN01株为例，BCA试剂盒采用碧云天BCA试剂盒。
[0022]实施例1支原体CCU
50
的测定方法
[0023]用新鲜无菌适宜的MS培养基添加进96孔细胞培养板，0.1ml/孔备用；用新鲜无菌适宜的MS培养基将待检样品作10倍系列倍比稀释至10
‑9，分别从10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8和10
‑9管中各吸取0.1ml接种到每孔含0.1ml的96孔细胞培养板，各稀释度6孔重复；96孔板上
下两排分别添加新鲜无菌适宜的MS培养基，0.1ml/只。接种后置于37℃培养箱中静置培养7日，观察各稀释度变色孔数。根据Reed
‑
Muench法计算待检样品的半数变色单位(CCU
50
)。
[0024]实施例2BCA试剂盒标准曲线的建立
[0025]取禽滑液囊支原体毒种(HN01株)，含量不低于10
9.0
CCU
50
/ml，用新鲜无菌适宜的MS培养基将毒种作连续2倍系列倍比稀释，各稀释度总体积不低于50ml，分别将2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种支原体含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将支原体抗原液离心重悬后，用BCA法检测重悬后支原体抗原液中支原体菌体蛋白浓度；(2)根据支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系计算得到步骤(1)中的支原体菌体蛋白浓度对应的支原体培养液变色单位。2.根据权利要求1所述的支原体含量的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为：12000～15000rpm，2～8℃，3～5min。3.根据权利要求1所述的支原体含量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，支原体菌体蛋白浓度与支原体培养液变色单位的线性关系的获得方法为：取支原体培养高峰期前发酵不同时间点的抗原液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，赵益超，张艳，李婷婷，徐秋荣，蔡旻旻，桑建君，陈武卫，
申请(专利权)人：国药集团扬州威克生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：