一种抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途，所述制备方法采用热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种的原核表达的重组蛋白1:1混合物作为抗原制备特异性卵黄抗体，最终制得的卵黄抗体具有杀菌消毒功能，能够预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染，该发明专利技术规避了用菌体直接作为抗原抗体产生的成分复杂、特异性和中和性不强的缺点，且制备的卵黄抗体无毒副作用，成本低廉，利于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途
本专利技术属于生物制药
，特别涉及一种白色念株菌卵黄抗体的制备方法，由该方法制备的卵黄抗体及其在杀菌消毒方面的用途，尤其是在预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染上的用途。
技术介绍
白色念珠菌(C.albicans)是一种重要的人体致病真菌，革兰氏染色呈阳性，外形呈卵圆形念珠状，通常寄生于人口腔、胃肠道、女性生殖道黏膜及体表潮湿部位，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，但当机体免疫功能或机体防御力下降时，白色念珠菌会在黏膜下大量繁殖，随后侵入深层组织，可引起反复性的浅表黏膜感染或者严重的系统感染。通常表现为阴道炎、鹅口疮等。由于对念珠菌现有的基础研究有限，目前临床上用于预防和治疗念珠菌病的药物也非常有限，常用的抗真菌类药物如伊曲康唑、克霉唑、咪康唑、两性霉素B等均易产生耐药性，且易产生过敏及毒副作用，对于轻微的感染及日常预防来说更易于采用无毒的生物制剂来完成。卵黄抗体是一种采自于鸡蛋中高产的生物抗体制剂，是免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体。在卵黄中仅含有IgG，禽类抗体简称为IgY。产蛋鸡注射抗原免疫后，鸡法氏囊内的B细胞随即分化成为浆细胞，分泌针对特异性抗原的特异性抗体，这些抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，其在卵细胞中大量蓄积，且其浓度远高于血液中的浓度，据报道单个卵黄中抗体含量可达200mg，这些优势为卵黄抗体的大规模生产和提纯创造了条件。且卵黄抗体在多种温湿度、酸碱性等环境中有较好的稳定性。为其大规模应用又创造了生产和保存条件。卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，经过5次冻融，其抗原结合活性几乎都不受影响。这也为卵黄抗体的工业化生产灌装，衍生抗体制剂创造了条件。
技术实现思路
基于当前卵黄抗体在杀菌消毒市场上，尤其是在预防及治疗白色念珠菌感染市场上的空白及市场需求，本专利技术目的在于提供了抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途，具体是运用热休克蛋白90(Hsp90)、甘露糖蛋白65(MP65)两种抗原制备的卵黄抗体，并公开了将其用于预防及治疗白色念球菌病感染的医学用途。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：本专利技术提供了一种重组DNA，重组DNA片段中包含白色念球菌热休克蛋白90核苷酸和甘露糖蛋白65核苷酸，所述热休克蛋白90的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列为SEQIDNO：4所示。本专利技术还提供了一种由重组DNA作为抗原制备的卵黄抗体。本专利技术提供的免疫性抗原包含热休克蛋白90抗原的氨基酸序列和甘露糖蛋白65的氨基酸序列，优选的热休克蛋白90抗原的氨基酸如SEQIDNO：1所示，优选的甘露糖蛋白65的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步的，卵黄抗体的制备方法，如下：(1)抗原制备：选取白色念球菌热休克蛋白90核苷酸及甘露糖蛋白65核苷酸序列全长作为抗原序列，表达，复性蛋白，作为免疫用抗原；(2)免疫蛋黄的获取：用(1)中所述免疫抗原注射产蛋鸡，收集鸡胚，提取卵黄；(3)卵黄抗体的提取纯化：收集(2)所述的卵黄，离心、透析、并进行溶液处理、最终得到卵黄抗体纯品。进一步的，上述卵黄抗体的制备方法中，所述免疫用抗原中热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种抗原的混合比例为1∶1。进一步的，所述的免疫卵黄的获取方法如下：每次每只注射2mg抗原，首次免疫两周后进行免疫加强，后每个15天进行一次免疫加强，免疫三次后再加强免疫一次，加强免疫10天后收集的鸡胚提取的卵黄。进一步的，所述的卵黄抗体的提取纯化方法如下：(1)卵黄加磷酸盐缓冲液匀浆，静置，离心，透析后截留分子量为150KD的抗体粗品，通过磷酸盐缓冲液透析，并在37℃重溶解15min后所得溶液为卵黄抗体粗溶液；(2)向(1)中所得卵黄抗体粗溶液中等体积加入饱和硫酸铵溶液，得到沉淀；(3)将(2)的沉淀以PBS缓冲液溶解，硫酸铵溶液处理后，静置得到沉淀物及为卵黄抗体粗纯品；(4)测定卵黄抗体的纯度，重复(2)(3)步骤直至卵黄抗体纯度达到80％，将制备的卵黄抗体放置于4℃备用，长期保存加入冻干保护剂，冻干保存。本专利技术提供了一种卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用。进一步的，卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用，具体为预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染。卵黄抗体在制备消毒杀菌剂包括软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、擦剂、喷雾剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂。同时可以将卵黄抗体用于制备用于消毒预防感染用的纸巾、擦剂、洗护剂、牙膏和漱口水。本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术应用白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65全长作为抗原，其特异性高针对性强，优于全菌体作为抗原，不产生其余非针对性，中和性不强的抗体，且其诱导产生的卵黄抗体可有效的结合到白色念珠菌的不同部位，降低感染风险。本专利技术用于预防及治疗白色念球菌感染时具有成分安全，不产生耐药性的优点。本专利技术提供的制备的卵黄抗体的方法，成本低廉，工艺简单，易于大规模生产。具体实施方式实施例1抗原制备：根据GENBANK中获取白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65基因全长，查找开放阅读框，获得其核苷酸序列，其中热休克蛋白90抗原的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。甘露糖蛋白65核苷酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。设计引物并合成引物，热休克蛋白90、甘露糖蛋白65引物序列如下：Hsp90上游：5’-TCAGGATCCATGGCTGACGCAAAAG-3’(SEQIDNO：5)；Hsp90下游：5’-GACCTCGAGTTAATCAACTTCCAT-3’(SEQIDNO：6)；MP65上游：5’-TCAGAATTCATGTTATTCAAGTCTT-3’(SEQIDNO：7)；MP65下游：5’-CGCCTCGAGTTAGTTAGAGTAAA-3’(SEQIDNO：8)。引物同样交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物合成后超纯水稀释(按照引物合成管上的标注体积稀释)。保存在-20℃备用。按照下表的反应体系PCR扩增基因片段，并凝胶回收(按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒操作说明书操作)。PCR反应体系为：模板(合成产物)1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；2×MasterMix10μL；水8μL。PCR反应条件为：95℃10min；94℃90s，53℃90s，72℃90s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR产物和pMD-18T连接8h，连接产物加入感受态E.coliTop10中冰浴30min，42℃热休克90s，随后立即冰浴2-3min。涂板(含氨苄西林100μg/ml的LB平板)37℃培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组DNA，其特征在于，重组DNA片段中包含白色念球菌热休克蛋白90核苷酸和甘露糖蛋白65核苷酸，所述热休克蛋白90的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组DNA，其特征在于，重组DNA片段中包含白色念球菌热休克蛋白90核苷酸和甘露糖蛋白65核苷酸，所述热休克蛋白90的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列为SEQIDNO:4所示。


2.权利要求1所述的重组DNA作为抗原制备的卵黄抗体。


3.根据权利要求2所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，
（1）抗原制备：选取白色念球菌热休克蛋白90核苷酸及甘露糖蛋白65核苷酸序列全长作为抗原序列，表达，复性蛋白，作为免疫用抗原；
（2）免疫蛋黄的获取：用（1）中所述免疫抗原注射产蛋鸡，收集鸡胚，提取卵黄；
（3）卵黄抗体的提取纯化：收集（2）所述的卵黄，离心、透析、并进行溶液处理、最终得到卵黄抗体纯品。


4.根据权利要求3所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫性抗原包含热休克蛋白90抗原的氨基酸序列和甘露糖蛋白65的氨基酸序列，所述热休克蛋白90抗原的氨基酸如SEQIDNO:1所示，所述甘露糖蛋白65的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


5.根据权利要求3所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫用抗原中热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种抗原的混合比例为1:1。


6.根据权利要求3所述的所述的卵黄抗体的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：高江明，徐晓芳，杨萌琳，
申请(专利权)人：徐晓芳，
类型：发明
国别省市：山东;37