同时靶向HPV16 L1及HPV16 E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了同时靶向HPV16 L1及HPV16 E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备方法，采用SEQ ID NO：1编码的HPV16 L1蛋白与E5、E6、E7抗原肽组合制备宫颈癌疫苗。本发明专利技术利用生物信息学分析针对人类主要HLA型别筛选评分较高的长肽肽片段，结合体外试验得到免疫效果最强的E5E6E7多肽片段组成双效疫苗核心，应用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统制备L1‑E5E6E7宫颈癌疫苗,该宫颈癌疫苗具有预防、治疗双重效应。

【技术实现步骤摘要】
同时靶向HPV16L1及HPV16E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备方法一、
本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域。二、
技术介绍
子宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,在全球妇女癌症发病率中居第2位，严重威胁着广大妇女的健康和生命。WHO资料显示，全球每年宫颈癌的新发病例为45万例，其中80％以上发生在发展中国家。我国是仅次于智利的宫颈癌第二高发国家。虽然国际上已开发出九价，四价，二价宫颈癌预防性疫苗，但它们只能对尚未存在HPV感染的人群起效，对于那些长期持续感染HPV的患者单纯的预防性治疗无法解决其实际问题，特异的治疗性疫苗的研发迫在眉睫；另外，大多数宫颈癌患者及术后复发患者多为HPV整合感染所致，预防性疫苗对整合后的HPV感染无明显效应。对于术后复发的宫颈疾病患者多为HPV整合感染所致，以上市的针对L1的预防性疫苗对整合后的HPV感染无能为力。因此,一个可以兼顾HPV持续感染、HPV整合前后感染状态的治疗措施亟为临床所需也正成为新的研究焦点。HPV感染是子宫颈癌首要致癌因素和重要启动因子已被公认。迄今为止已发现不同型别HPV一百余种,而不同型别的划分是基于在L1,E6,E7的编码基因序列中有10％的序列与现存型别的相关序列不符。根据致病特点分为高危型和低危型,99％的子宫颈癌都与高危型的HPV有关,其中近60％的子宫颈癌因感染HPV16导致。HPV早期区(E区)基因编码的蛋白有E1,E2,E4,E5,E6,E7,其中E1,E2与病毒的复制和转化有关；E4可能参与病毒从被感染的细胞中释放和部分的病毒包装；E5蛋白是一种最小的转化蛋白，在促进细胞的恶性转化中发挥作用,并且与HPV感染早期抑制DNA损伤的细胞凋亡有关。在HPV感染早期,在CIN阶段E5有大量表达,且在整合之前，E5的表达与宫颈上皮病变的程度正相关。另外，我们前期的研究结果提示：HPV16，18E5(1)可以明显促进细胞的恶性增殖，并改变细胞周期；(2)通过下调P21而抑制细胞调亡；(3)通过与细胞有丝分裂纺锤体检测点蛋白的相互作用而导致细胞分裂异常，异型核出现，是肿瘤发生之初的关键因素之一；(4)我们的动物实验证实有HPV16E5表达的肿瘤生长及恶性程度明显高于对照组。高危型HPVE6,E7是一直以来的研究热点，它们主要参与病毒恶性转化,并经由相关机制分别与p53、Rb相互作用,使细胞周期失控而发生永生化。有研究指出，在HPV感染之初，E5有效的增强了E6，E7的恶性转化作用，并且这种转化辅助是必须的。在HPV的8种蛋白中L2,E1,E4均不能使被感染者产生天然免疫,而L1在感染后的数周或数年将有50％～100％的被感染者会产生保护性抗体,这也是HPV预防性疫苗制备的基础之一；E5可通过抑制MHC-1的表达，而介导免疫耐受；E7与癌前病变期的迟发型超敏反应有关。然而，针对E6，E7的疫苗仅能80％抑制HPV相关疾病的发生，完全阻断这两个“经典”的靶点仍不能彻底根除HPV的恶性作用。这迫使我们进行更深层次的思考，基于HPV的致病机制和天然的免疫原性,在HPV的致病过程中除了E6，E7外是否还有其他的关键因素存在？而E5这个在HPV整合前有着同样恶性潜能的靶点是否就是罪魁祸首？由此，我们设想：针对在HPV致病机制中有恶性作用的一系列位点，多角度遏制HPV的致病作用，从源头上杜绝宫颈癌的发生，靶向E5，E6，E7三者构建HPV疫苗，使机体对已知的HPV多个可能的直接致病靶点产生有效免疫。HPV晚期区的主要衣壳蛋白L1在真核细胞内能自我组装成病毒样颗粒(viruslikeparticles,VLPs)，其结构和抗原表位与天然病毒相似，不含病毒核酸，与宿主细胞受体的结合能力与原病毒相似，并可通过与病毒相同的途径呈递给宿主免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫反应，且在L1羧基端加入含60个氨基酸的异源蛋白并不影响L1和异源蛋白的免疫原性和空间构象，是预防HPV感染的可靠靶点。三、
技术实现思路
基于以上技术背景和重大的医疗需求，本专利技术将公开一种多目标同时靶向HPV16E5E6E7三个关键致病因素(治疗宫颈癌的靶点)和HPV16L1(预防宫颈癌靶点)兼具预防治疗双重效应的宫颈癌疫苗的筛选和验证及制备方法，我们希望通过这种兼具预防和治疗功效的疫苗来有效解决目前HPV16阳性肿瘤治疗的局限，同时为开辟中国人制备国人自己的宫颈癌疫苗奠定基础。我们将L1(预防宫颈癌的靶点)与“E5E6E7长肽”相结合。利用生物信息学平台分析针对人类主要组织相容性复合体MHC分子(HLA)的抗原表位筛选肽段。同时，利用BactoBac昆虫细胞-杆状病毒表达系统安全高效，可容载大片段外源基因，表达产物的结构功能，抗原性和免疫原性等均与天然蛋白相似等优点，合成“L1+E5E6E7”该研究内容在国内外尚无同类报道。本专利技术采用以下技术方案：一组免疫抗原肽编码核酸序列，由三个核酸片段组成，这三个核酸片段分别编码E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，和E7：YMLDLQPET。上述HPV16E5、E6、E7三个肽片段的编码核酸序列在制备用于肿瘤及其在研究HPV16相关疾病的预防和治疗的制剂中的用途。本专利技术还进一步提供一种疫苗制剂，将SEQIDNO：1编码的HPV16L1蛋白与上述的E5、E6、E7抗原肽组合制备得到的宫颈癌疫苗制剂。本专利技术还进一步提供一种制备嵌合病毒样颗粒cVLPs的方法，将上述的三个核酸片段以及SEQIDNO：1所示的HPV16L1利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行表达；分别通过构建、验证、扩增、纯化，最终获得HPV16L1+“E5E6E7”嵌合病毒样颗粒cVLPs，其中包装扩增HPV16L1VLP做对照研究。其中制备权利要求上述的cVLPs的方法，其特征在于利用BactoBac杆状病毒表达系统，用PCR方法克隆HPV16L1+“E5E6E7”基因，测序鉴定后与线性化的pFastHTb进行连接为pFastHTb一HPV16L1+“E5E6E7”，使pFastHTb一HPV16L1+“E5E6E7”与DH10BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid一HPV16L1+“E5E6E7”克隆，提取Bacmid一HPV16L1+“E5E6E7”转染昆虫细胞Sf-9获得有感染力的病毒，利用病毒感染Sf-9细胞进行蛋白表达扩增，用RT-PCR和Westernblot进行鉴定，筛选出表达HPV16型L1+“E5E6E7”的cVLPs。其中HPV16L1的上下游引物序列分别为：L1-P1：5'CGGAATTCAAATGTGCCTGTATACACGGGTC3'；L1-P2：5'CGCGGATCCGCGCACACATATTACTTCCTGG3'。本专利技术还提供一种上述方法制备得到的嵌合病毒样颗粒cVLPs。本专利技术还提供一种上述的嵌合病毒样颗粒cVLPs制备方法制备得到的cVLPs在制备作为兼具预防和治疗双重作用的宫颈癌疫苗。本专利技术还提供一种上述的嵌合病毒样颗粒cVLP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组免疫抗原肽编码核酸序列，其特征在于由三个核酸片段组成，这三个核酸片段分别编码E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，和E7：YMLDLQPET。/n

【技术特征摘要】
20190225 CN 20191013602761.一组免疫抗原肽编码核酸序列，其特征在于由三个核酸片段组成，这三个核酸片段分别编码E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，和E7：YMLDLQPET。


2.权利要求1中所述的HPV16E5、E6、E7三个肽片段的编码核酸序列在制备用于肿瘤及其在研究HPV16相关疾病的预防和治疗的制剂中的用途。


3.SEQIDNO：1编码的HPV16L1蛋白与权利要求1所述的E5、E6、E7抗原肽组合制备得到的宫颈癌疫苗制剂。


4.一种制备嵌合病毒样颗粒cVLPs的方法，其特征在于将权利要求1中所述的三个核酸片段以及SEQIDNO：1所示的HPV16L1利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行表达；分别通过构建、验证、扩增、纯化，最终获得HPV16L1+“E5E6E7”嵌合病毒样颗粒cVLPs，其中包装扩增HPV16L1VLP做对照研究。


5.制备权利要求4所述的cVLPs的方法，其特征在于利用BactoBac杆状病毒表达系统，用PCR方法克隆HPV16L1+“E5E6E7”基因，测序鉴定后与线性化的pFastHTb进行连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，廖书杰，张维娜，黄晓园，
申请(专利权)人：武汉凯德维斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42