从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法技术

公开了一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，该方法适用于工业生产目的，以从重组的治疗性蛋白质中去除半乳糖凝集素和其他宿主细胞污染物(例如金属阳离子)。

Purification of glycosylated protein from host cell galectin and other pollutants

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法本申请要求于2017年8月17日在美国专利商标局提交的美国临时专利申请序列号62/546,558的优先权。序列表本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2018年8月14日，名称为JUST0381_SL.txt，大小为4,148字节。
专利
本专利技术涉及从污染的宿主细胞蛋白质和金属离子中纯化重组产生的蛋白质的方法。
技术介绍
相关技术的讨论重组治疗性蛋白质的工业生产要求从目的蛋白质中有效去除污染性宿主细胞蛋白质和金属离子，以满足严格的监管标准。当糖基化的重组蛋白富含末端β-半乳糖残基时，从与这些半乳糖苷残基可逆地结合的宿主细胞蛋白半乳糖凝集素(galectin)中纯化重组蛋白是关键问题。半乳糖凝集素是可特异性结合β-半乳糖苷的动物凝集素。脊椎动物中已描述了十二种半乳糖凝集素，它们属于三个不同的亚组：原型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-1，-2，-7，-10，-13，-14)、串联重复型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-4，-8，-9，-12)和嵌合型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-3)。据报道，这些半乳糖凝集素蛋白参与宿主细胞中的细胞相互作用和肿瘤转化。(参见，例如，VarkiA、CummingsRD、EskoJD、FreezeHH、StanleyP、BertozziCR、HartGW、EtzlerME编写的EssentialsofGlycobiology(《糖生物学概要》)第2版，ColdSpringHarbor(纽约)：ColdSpringHarborLaboratoryPress(纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社)，2009年，第33章：CummingsRD和LiuFT，Galectins(半乳糖凝集素)；Gitt，MA等，Galectin-4andgalectin-6aretwocloselyrelatedlectinsexpressedinmousegastrointestinaltract(半乳糖凝集素-4和半乳糖凝集素-6是在小鼠胃肠道中表达的两种密切相关的凝集素)，JBiolChem.273(5)：2954-60(1998)；Bidon，N.等，Galectin-8：acomplexsub-familyofgalectins(Review)(半乳糖凝集素-8：一种半乳凝素的复杂亚家族(综述))，IntJMolMed.8(3)：245-50(2001)；Hadari，YR等，Galectin-8.Anewratlectin，relatedtogalectin-4(半乳糖凝集素-8：与半乳糖凝集素-4有关的新的大鼠凝集素)，JBiolChem.270(7)：3447-53(1995)；Sato，M.等，Functionalanalysisofthecarbohydraterecognitiondomainsandalinkerpeptideofgalectin-9astoeosinophilchemoattractantactivity(半乳糖凝集素-9的碳水化合物识别域和连接肽的关于嗜酸性粒细胞趋化活性的功能分析)，Glycobiology12(3)：191-97(2002)；Yang，RY等，Cellcycleregulationbygalectin-12，anewmemberofthegalectinsuperfamily(半乳糖凝集素超家族新成员半乳糖凝集素-12对细胞周期的调节)，JBiolChem.276(23)：20252-60(2001)；Ramaswamy，S等，Structuralbasisofmultivalentgalactose-baseddendrimerrecognitionbyhumangalectin-7(人半乳糖凝集素-7识别多价半乳糖基树枝状聚合物的结构基础)，FEBSJ.2015Jan；282(2)：372-87(2015)；Patnaik，SK等，ComplexN-glycansarethemajorligandsforgalectin-1，-3，and-8onChinesehamsterovarycells(复合型N-聚糖是中国仓鼠卵巢细胞中半乳糖凝集素-1、-3和-8的主要配体)，Glycobiology16(4)：305-17(2006))。半乳糖凝集素-3的分子量(MW)为约30kDa，并包含约130个氨基酸的碳水化合物识别结合结构域(CRD，carbohydrate-recognition-bindingdomain)，CRD使得能够特异性结合β-半乳糖苷。据报道，半乳糖凝集素-3结合的蛋白质包括：层粘连蛋白；纤连蛋白；hensin蛋白；弹性蛋白；IV型胶原蛋白；肌腱蛋白C；肌腱蛋白R；整联蛋白α1β1、整联蛋白α4β7、整联蛋白α6β1和整联蛋白αMβ1；VEGFR2；NG2；以及氨肽酶N。(Funasaka等，Galectin-3inangiogenesisandmetastasis(半乳糖凝集素-3在血管生成和转移中的作用)，Glycobiology24(10)：886-891(2014))。据报道，宿主细胞蛋白半乳糖凝集素-3是重组产生的因子IX蛋白的污染物。(Blostein等，Galectin-3BindingProteinContaminatesthePurificationofRecombinantFactorIX(半乳糖凝集素-3结合蛋白污染重组因子IX的纯化)，Blood108：1038(2006)。阿柏西普(Aflibercept)是另一种重组治疗性蛋白质，其通常富含末端β-半乳糖残基。阿柏西普蛋白包括两种主要成分：来自人VEGF受体1和受体2胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分，其融合至人IgG1的Fc部分。(参见，Papadopoulos等，Modifiedchimericpolypeptideswithimprovedpharmacokineticproperties(具有改善的药代动力学性质的经修饰的嵌合多肽)，WO00/75319A1；US7070959B2)。美国食品药品监督管理局(FDA)于2011年11月批准了阿柏西普上市销售，欧洲药品管理局(EMA)于2012年11月批准了阿柏西普上市销售。商标名称为(RegeneronPharmaceuticals，Inc.)的阿柏西普被用作眼科药剂，用于治疗眼病或眼疾，例如，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)导致的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病性视网膜病变(DR)以及新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。商标名称为(RegeneronPharmaceuticals，Inc.)的阿柏西普(Ziv-aflibercep本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，其中，所述方法包括以下步骤：/n(a)在约中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白(POI)和半乳糖凝集素宿主细胞蛋白(HCP)污染物，其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的C

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170817 US 62/546,5581.一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在约中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白(POI)和半乳糖凝集素宿主细胞蛋白(HCP)污染物，其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的CH2结构域和CH3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基，半乳糖凝集素-3污染物可逆地结合到所述末端β-半乳糖残基；
(b)用pH为约6.0至6.5的包含1M至3M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质；
(c)用pH低于约4的包含柠檬酸或柠檬酸盐的缓冲液，将POI从蛋白A基质洗脱到洗脱合并液中，并且：
(i)如果洗脱合并液的碱性大于pH3.3至3.7的pH范围，则用柠檬酸将洗脱合并液滴定至pH3.3至3.7，以及
(ii)可选地，将洗脱合并液在pH3.3至3.7保持足以灭活病毒的一段时间；
(d)在pH为5.0至5.5的约2mS至15mS的低电导率缓冲液中，使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合到阳离子交换基质；
(e)用电导率递增的电解质浓度梯度，最高约40mS至100mS，将POI从阳离子交换基质洗脱到CEX洗脱合并液中；以及
(f)在pH5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱(HIC)基质上，并洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·A·康奈尔克罗利，M·J·麦克卢尔，R·O·吉莱斯皮，
申请(专利权)人：济世易为生物有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US