携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种携带自杀基因的ROBO1 CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，为了增加CAR‑NK疗法的安全性和可控性，我们在目前ROBO1 CAR‑NK细胞的基础上，通过慢病毒转染的技术，将一个自杀基因开关原件整合至基因组中，形成带有自杀基因的CAR‑NK。通过自杀基因的加入，可以更好地控制CAR‑NK细胞，进一步增加临床上的安全性。

Robo1 car-nk cell carrying suicide gene and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物制药
，涉及一种NK细胞及其制备方法和应用，具体涉及一种携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，基于CAR-T细胞的免疫疗法受到了界内的广泛关注，作为一种“活的”药物，CAR-T疗法与传统药物有着很大的区别。首先，该疗法需要从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的T细胞扩增、回输至患者体内。例如，CD19CAR-T细胞在CD19阳性恶性肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗(Gruppetal.,2013)的可行性。并且，CAR-T细胞靶向多种不同的肿瘤抗原正在积极的进行临床开发(Kalosetal.,2013)。尽管CAR-T疗法已经展现出巨大的潜力，但是有明显的局限性。首先，细胞必须分离出体外(这一过程耗时长且费用高)。而且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程，虽然目前CAR-T在向通用型的CAR-T发展，但其实又增加了临床风险以及操作难度。并且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程；此外，面对CAR-T的高额费用(参考目前上市的两家公司，诺华和凯特)，这些局限性可能会导致一些有望受益的患者无法接受CAR-T免疫疗法。另外，CAR-T疗法还存在严重的毒性或副作用，包括细胞因子释放综合征CRS、神经毒性等。自然杀伤(NK)细胞是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。类似于T细胞，NK细胞可修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强抗肿瘤活性。NK细胞在癌症免疫监视中起重要作用，并且代表用于过继癌症免疫疗法的重要效应细胞类型。与T细胞相比，它们不需要事先活化和识别复合体MHC分子呈递的肽抗原。相反，通过编码的细胞表面受体偶联CD3ζ分子，在适当的刺激下，NK细胞可表现出杀伤活性。因此，CAR-NK疗法有望成为肿瘤细胞治疗的重要发展方向。我们通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后，大大增加了它的靶向性；同时装上自杀基因开关原件，进一步增加CAR-NK细胞的安全性和可控性以及临床前的实验也证明我们的CAR-NK确实没有明显的毒副作用。但是为了进一步增加CAR-NK疗法的安全性和有效性，需要进一步研发改进。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的一个目的是提供一种携带自杀基因的核苷酸序列，本专利技术的另一个目的是提供一种携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞，本专利技术的又一个目的是提供一种携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞的应用，通过在ROBO1CAR-NK细胞的基础上增加自杀基因开关原件，可以更好地控制CAR-NK细胞，进一步增加临床上的安全性。本专利技术提供一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。在本专利技术的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为iCaspase9、EGFRt、CD20、雷帕霉素和/或RQR8。在本专利技术的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为iCaspase9，所述iCaspase9包括FKBP12-F36V和ΔCaspase9，所述FKBP12-F36V的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示，所述ΔCaspase9的核苷酸序列为SEQIDNO：2所示。在本专利技术的一个优选实施例中，所述FKBP12-F36V和ΔCaspase9通过Linker连接，所述Linker的核苷酸序列为SEQIDNO：3所示；接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一，通过适当的接头序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为Linker。它不影响目的蛋白各自的功能，而且能够使融合蛋白形成正确的空间结构，更好的发挥生物学活性。在本专利技术的一个优选实施例中，所述iCaspase9自杀基因上还设有标签基因所述标签基因优选为CD19、Myc、Flag、HA或His，通过对标签基因的检测来证明目的蛋白是否得到了正确的表达。在本专利技术的一个优选实施例中，所述标签基因可为CD19、Myc、Flag、HA或His，优选为CD19；所述iCaspase9自杀基因上还设有剪切基因，所述剪切基因为T2A或P2A，优选为T2A；所述CD19标签的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。通过标签基因CD19，能够识别胞内表达的Caspase9蛋白，此外，在剪切基因的作用下，能够成功将mRNA翻译后的融合蛋白的标签与iCaspase9剪切开。CD19是一段截短的CD19，包括CD19的胞外段，跨膜区和胞内截短的一段序列(不含胞内信号传导区域)，只是作为检测自杀基因的标签，不具有其他任何的功能，并且CD19作为自杀基因的检测标签也已经在临床病人上显示比较好的检测效果，比其它标签具有更高的安全性；两个基因通过T2A多肽连接成为一个ORF，mRNA翻译成为一个融合蛋白，但这个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白，这两个蛋白分别各自表达，功能互不影响，T2A的优点在于它序列很短，对蛋白功能基本上不会造成什么影响。在本专利技术的一个优选实施例中，所述iCaspase9的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。在本专利技术的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为EGFRt，所述EGFRt包括EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV和跨膜区。在本专利技术的一个优选实施例中，所述EGFRt的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或ScFv。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。/n

【技术特征摘要】
20190315 CN 20191019653151.一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。


2.根据权利要求1所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为iCaspase9、EGFRt、CD20、雷帕霉素和/或RQR8。


3.根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为iCaspase9，所述iCaspase9包括FKBP12-F36V和ΔCaspase9，所述FKBP12-F36V的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示，所述ΔCaspase9的核苷酸序列为SEQIDNO：2所示；
优选地，所述FKBP12-F36V和ΔCaspase9通过Linker连接，所述Linker的核苷酸序列为SEQIDNO：3所示；
更为优选地，所述iCaspase9上还设有标签基因，所述标签基因优选为CD19、Myc、Flag、HA或His；
进一步优选地，所述标签基因为CD19，所述iCaspase9上还设有剪切基因，所述剪切基因优选为T2A；所述CD19的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；
所述iCaspase9的核苷酸序列优选如SEQIDNO：6所示。


4.根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为EGFRt，所述EGFRt包括EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV和跨膜区；
优选地，所述EGFRt的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种；
优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；
更为优选地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或ScFv；
进一步优选地，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种，所述的跨膜结构域优选为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；所述的共刺激信号传导区优选包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。


6.根据权利要求5所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括结构为ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，其中所述的ScFv能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；
优选地，所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩昆昆，傅剑敏，周敏，曾凡军，王强，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32