携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种携带自杀基因的ROBO1 CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，为了增加CAR‑NK疗法的安全性和可控性，我们在目前ROBO1 CAR‑NK细胞的基础上，通过慢病毒转染的技术，将一个自杀基因开关原件整合至基因组中，形成带有自杀基因的CAR‑NK。通过自杀基因的加入，可以更好地控制CAR‑NK细胞，进一步增加临床上的安全性。

Robo1 car-nk cell carrying suicide gene and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物制药
，涉及一种NK细胞及其制备方法和应用，具体涉及一种携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，基于CAR-T细胞的免疫疗法受到了界内的广泛关注，作为一种“活的”药物，CAR-T疗法与传统药物有着很大的区别。首先，该疗法需要从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的T细胞扩增、回输至患者体内。例如，CD19CAR-T细胞在CD19阳性恶性肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗(Gruppetal.,2013)的可行性。并且，CAR-T细胞靶向多种不同的肿瘤抗原正在积极的进行临床开发(Kalosetal.,2013)。尽管CAR-T疗法已经展现出巨大的潜力，但是有明显的局限性。首先，细胞必须分离出体外(这一过程耗时长且费用高)。而且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程，虽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。/n

【技术特征摘要】
20190315 CN 20191019653151.一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。


2.根据权利要求1所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为iCaspase9、EGFRt、CD20、雷帕霉素和/或RQR8。


3.根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为iCaspase9，所述iCaspase9包括FKBP12-F36V和ΔCaspase9，所述FKBP12-F36V的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示，所述ΔCaspase9的核苷酸序列为SEQIDNO：2所示；
优选地，所述FKBP12-F36V和ΔCaspase9通过Linker连接，所述Linker的核苷酸序列为SEQIDNO：3所示；
更为优选地，所述iCaspase9上还设有标签基因，所述标签基因优选为CD19、Myc、Flag、HA或His；
进一步优选地，所述标签基因为CD19，所述iCaspase9上还设有剪切基因，所述剪切基因优选为T2A；所述CD19的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；
所述iCaspase9的核苷酸序列优选如SEQIDNO：6所示。


4.根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述诱导自杀基因为EGFRt，所述EGFRt包括EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV和跨膜区；
优选地，所述EGFRt的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种；
优选地，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；
更为优选地，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或ScFv；
进一步优选地，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种，所述的跨膜结构域优选为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；所述的共刺激信号传导区优选包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。


6.根据权利要求5所述的携带自杀基因的核苷酸序列，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括结构为ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，其中所述的ScFv能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；
优选地，所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩昆昆，傅剑敏，周敏，曾凡军，王强，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32