EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种EB病毒阴性的NK‑92细胞及其制备方法，通过基因编辑技术成功去除了NK‑92细胞中携带的EB病毒，获得了EB病毒阴性的NK‑92细胞株；提高了NK‑92细胞的安全性，为后续以NK‑92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础。

Epstein Barr virus negative NK-92 cells and its preparation

【技术实现步骤摘要】
EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法
本专利技术涉及技术生物医药
，尤其是一种EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法。
技术介绍
自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节作用。NK细胞一直被认为是杀死癌细胞和治疗感染的绝佳武器。与T淋巴细胞不同，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞,是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。人类NK细胞约占全血淋巴细胞的10％～15％。目前研究认为NK细胞特异性表达CD56，而缺乏T细胞抗原CD3。由于NK细胞纯化和体外大量扩增存在一定的技术难度。因此科学家试图建立细胞系，用同种异体NK细胞进行肿瘤生物治疗，目前国内外科学家在NK抗肿瘤研究中已先后建立HANK、KHYG-1、NK-92、NKL、PLT、MOTN、IMC-1、NK-YS、KAI3、SNK-1、SNK6以及YT、NK3.3等，还有通过稳定转染IL-2获得的NK-92MI、IL-2/NKL、IL-2/NK3.3等转基因NK细胞系。而NK-92细胞是1992年建立的来自非何杰金淋巴瘤患者的NK细胞系，由于其免疫表型为CD56brightCD16-，无ADCC效应，类似于外周血CD56brightNK细胞。目前NK-92是进入临床研究的重要细胞系之一，它对不同来源肿瘤的细胞系，如白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。研究发现NK-92表达大量的活化受体，如：NKp30、NKp46、2B4、NKG2D、CD28等，而抑制受体的表达却极少，只有NKGA/B和低水平的KIR2DL4与ILT-2等，几乎完全缺乏大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs，如p58复合体(p58复合体通过结合靶细胞上的HLA抗原而抑制NK细胞的杀伤)，却保留有穿孔素和颗粒酶B介导的细胞毒作用。它的建立，促进了其在肿瘤过继免疫治疗中的应用，并为深入开展研究NK细胞的特征、功能、进一步揭示它在免疫系统中的确切作用，提供了有力的研究材料。Epstein-BarrVirus(简称为EBV或EB病毒)为疱疹病毒科嗜淋巴细胞属的成员，在人群中广泛感染，根据血清学调查，我国3～5岁儿童EB病毒VCA-lgG抗体阳性率达90％以上，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。青年期发生原发感染，约有50％出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播，也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，被病毒感染的细胞具有EB病毒的基因组，以环状DNA形式游离在胞浆或整合于染色体内，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。目前EB病毒临床检测的主流方法为血清学检测，主要检测患者血清中的VCA、EA或EBNA1等抗原，同时也可以结合荧光定量PCR的方法对EB病毒潜伏期表达基因EBNA进行检测，从而确定患者EB病毒感染情况。EB病毒可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。研究表明EB病毒主要导致原发性疾病为传染性单核细胞增多症，此外还与多种人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌及免疫缺陷患者的B淋巴细胞瘤等多种癌症的发生密切相关。大量研究表明，NK-92细胞为EB病毒阳性细胞(DrexlerHG,DirksW,MacLeodRAF,SteubeKG,UphoffCC.CatalogueofHumanandAnimalCellLines.8thed.DSMZ:Braunschweig,2001.)，在基于NK-92为基础的细胞免疫治疗中，病人存在潜在性致病风险。国内临床相关法规已明确规定用于异体细胞治疗的产品要进行内外源病毒因子检测，且不得检出包含HIV、HBV、HCV、EBV、HTLV、CMV等在内的外源性病毒(《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，临床研究用人外周血来源NK细胞制剂规范》)。目前国内外尚无EB病毒阴性NK-92细胞株构建报道，为了进一步增加NK-92细胞在细胞免疫治疗领域的应用，去除EB病毒可能带来的潜在致病性，成为一种必然趋势。
技术实现思路
针对上述目的，本专利技术的目的是提供一种EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法，从而得到一种安全的NK-92细胞，为后续以NK-92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础。本专利技术一方面提供一种用于EB病毒敲除的sgRNA，包括与Cas9配合使用的至少一个sgRNA，所述sgRNA用于敲除EB中的EBNA1(EBVnuclearantigen1)、OriP(originofreplication)、EphA2(EphrinreceptorA2)、BALF4或LMP等其它重要区域。在本专利技术的优选实施例中，当所述sgRNA为两个sgRNA时，所述两个sgRNA分别为sgRNA1或sgRNA2，所述sgRNA1的序列如SEQIDNO:1所示或其同源序列；所述sgRNA2的序列如SEQIDNO:2所示或其同源序列。优选地，所述sgRNA1或sgRNA2的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。本专利技术的另一方面提供一种用于EB病毒敲除的系统，包括上述的sgRNA及与其配合使用的Cas9，所述Cas9与sgRNA相配合，构成用于阻断EB病毒复制的复合物。在本专利技术的优选实施例中，所述系统还包括质粒载体，所述Cas9设在所述载体上。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述Cas9的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示或其同源序列。优选地，所述同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。优选地，所述系统为CRISPR-Cas9系统。本专利技术的又一方面提供一种EB病毒阴性的NK-92细胞的制备方法，包括以下步骤：1)设计用于EB病毒敲除的至少一个sgRNA，再将其扩增得到用于EB病毒敲的sgRNA，所述sgRNA用于敲除EB病毒中的EBNA1(EBVnuclearantigen1)、OriP(originofreplication)、EphA2(EphrinreceptorA2)、BALF4或LMP等其它重要区域；2)将所述用于EB病毒敲的sgRNA和Cas9配合使用，形成用于阻断EB病毒复制的RNP复合物，即用于EB病毒敲除的系统；3)再将所述RNP复合物转入NK-92细胞中，再通过流式分选筛获得EB病毒阴性的NK-92细胞。在本专利技术的优选实施例中，在步骤1)中，当所述sgRNA为两个sgRNA时，所述两个sgRNA分别为sgRNA1或sg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于EB病毒敲除的sgRNA，包括与Cas9配合使用的至少一个sgRNA，所述sgRNA用于敲除EB病毒中的基因片段，所述基因片段包括EBNA1、OriP、EphA2、BALF4和LMP中的一个或多个。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于EB病毒敲除的sgRNA，包括与Cas9配合使用的至少一个sgRNA，所述sgRNA用于敲除EB病毒中的基因片段，所述基因片段包括EBNA1、OriP、EphA2、BALF4和LMP中的一个或多个。


2.根据权利要求1所述的用于EB病毒敲除的sgRNA，当所述sgRNA为两个sgRNA时，所述两个sgRNA分别为sgRNA1或sgRNA2，所述sgRNA1的序列如SEQIDNO:1所示或其同源序列；所述sgRNA2的序列如SEQIDNO:2所示或其同源序列；优选地，所述sgRNA1或sgRNA2的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。


3.一种用于EB病毒敲除的系统，其特征在于，包括权利要求1或2所述的sgRNA及与其配合使用的Cas9，所述Cas9与sgRNA相配合，构成用于阻断EB病毒复制的复合物。


4.根据权利要求3所述的用于EB病毒敲除的系统，其特征在于，所述系统还包括质粒载体，所述Cas9设在所述载体上。


5.根据权利要求3或4所述的用于EB病毒敲除的系统，其特征在于，所述Cas9的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示或其同源序列，所述同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；
优选地，所述系统为CRISPR-Cas9系统。


6.一种EB病毒阴性的NK-92细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)设计用于EB敲除的至少一个sgRNA，再将其扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗凤鹏，曹青，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32