一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的且含有正向标记基因的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，并在右臂后插入负向标记基因；(2)在上述敲入质粒的基础上建立同源修复的敲入质粒；(3)利用显微注射将敲入质粒和核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。本发明专利技术可实现比较非同源末端连接和同源修复的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法。
技术介绍
目前斑马鱼基因编辑领域内缺乏比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率比较的精准方法。斑马鱼gfap基因(胶质纤维酸性蛋白)是斑马鱼胶质细胞中特异表达的基因。斑马鱼中，由于gfap基因表达的时间点、表达强度以及细胞数量较多，且胶质细胞的形态相对特异，易于观察和统计分析，因此通过gfap基因的敲入能够很好的在活体条件下分析不同置换方法效率的比较。目前，在斑马鱼中缺乏比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可在斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：本专利技术的一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，序列如gttaagtttacttaatcggg；右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，序列如ggaatgatggatttggtcag；所述的左臂序列如SEQIDNO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：1中第1120-1821位所示；左右臂之间所述的正向外源标记基因为P2A-EGFP序列如SEQIDNO：1中的第331-1113位所示，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白；所述的反向外源标记基因为IRES2-tdTomato-pA序列如SEQIDNO：1中的第1829-4082位所示，可指示为非基因置换而是基因插入的负向标记荧光蛋白；(2)构建同源臂与非同源末端连接一样长的同源修复敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左臂中的核酸酶识别位点被破坏(CC突变为GG)，如SEQIDNO：2中的164-165位；其中右臂中的核酸酶识别位点被破坏(GG突变为CC)，如SEQIDNO：2中的1672-1673位，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；(3)构建同源臂长于非同源末端连接的同源修复敲入质粒，所述的左臂序列如SEQIDNO：3中第7-4725位所示，其中左臂中的核酸酶识别位点被破坏(CC突变为GG)，如SEQIDNO：3中的4559-4560位；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：3中第5515-6840位所示，其中右臂中的核酸酶识别位点被破坏(GG突变为CC)，如SEQIDNO：3中的6067-6068位；左右臂之间所述的正向外源标记基因为P2A-EGFP序列如SEQIDNO：3中的第4726-5508位所示，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白；所述的反向外源标记基因为IRES2-tdTomato-pA序列如SEQIDNO：3中的第6848-9108位所示，可指示为非基因置换而是基因插入的负向标记荧光蛋白。(4)利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养幼鱼，观察特定时间点不同标记基因EGFP和tdTomato的表达情况，统计分析其基因置换效率(见图1C-1E)。进一步地，在步骤(1)中，所述的同一基因为斑马鱼gfap基因。进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。更进一步地，在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，不同敲入质粒。进一步地，在步骤(4)中，所述的幼鱼为受精后3天。进一步地，在步骤(4)中，所述的观察和统计不同标记基因为EGFP和tdTomato，统计数据为含有仅EGFP标记胶质细胞的幼鱼比率，以及仅EGFP标记胶质细胞的平均数量。有益效果：本专利技术可精确比较同源修复和非同源末端连接实现长片段基因置换的效率比较。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术的方法通过gfap的瞬时敲入情况来统计比较分析同源修复和非同源末端连接实现基因置换的效率。(2)本专利技术新方法通过正反向的荧光标记可精确比较不同基因置换方法的效率，可用于提前选择合适的基因置换方法。附图说明下面将结合附图进一步说明，附图中：图1为本专利技术的比较非同源末端连接和同源重组介导的EGFP置换到斑马鱼gfap基因中的示意图和质粒功能验证。建立斑马鱼gfap基因的非同源性末端连接的EGFP置换质粒，并同时加入反向标记tdTomato，同时通过突变靶点构建同源重组质粒用于置换效率的比较。(A)在斑马鱼gfap基因座处非同源末端连接介导的基因置换方法的示意图；E9代表gfap的第九个外显子。终止密码子用粉红色线表示；左右两侧的导向gRNA序列为sgRNA1和sgRNA2，分别用红色和蓝色的箭头指示。中间的环表示用于置换的供体质粒；EGFP和E9之间使用可实现共表达的P2A序列连接，同源臂用带双箭头的褐色线表示，左右同源臂的长度分别为324个碱基对和1326碱基对。将供体与sgRNA1，sgRNA2和zCas9mRNA共同注射后，内源性E9在gfap位点被E9-P2A-EGFP序列取代，右同源臂后连接IRES2-tdTomato-pA序列，如非置换则可观察到胶质细胞同样被tdTomato所标记。黑色箭头表示用于鉴定的引物，包括目标区段的左侧、右侧连接处鉴定的引物；(B)仅注射左侧sgRNA靶点发现EGFP和tdTomato在胶质细胞中共表达，表明该敲入质粒功能的正确性。(C)非同源末端连接依赖的置换质粒结构图以及共注射核酸酶体系统后表明许多胶质细胞中仅表达EGFP，少量细胞表达EGFP和tdTomato，说明大部分细胞实现了EGFP的正确敲入和置换。(D)同源重组的质粒结构图(同源臂与C中非同源末端连接置换质粒中的长度相同)，共注射核酸酶系统后少量胶质细胞仅表达EGFP，无表达tdTomato的细胞。(E)同源重组的质粒结构图(同源臂长度远远大于C中非同源末端连接置换质粒中的长度)，共注射核酸酶系统后少量胶质细胞仅表达EGFP，无表达tdTomato的细胞。比例尺分别为：20μm。图2为本专利技术的比较非同源末端连接和同源重组介导的EGFP置换到斑马鱼gfap基因中的效率比较。(F)比较非同源末端连接和同源重组介导方法中的含有正确基因敲入的斑马鱼幼鱼比率，显示非同源末端连接介导的正确敲入比率显著提高；(G)比较非同源末端连接和同源重组介导方法中的含有正确基因敲入的平均每条鱼中的细胞数量，显示非同源末端连接介导的正确敲入比率显著提高。具体实施方式通过以下实施例进一步详细说明本专利技术，但应注意本专利技术的范围并不受这些实施例的任何限制。其它常用于进行基因编辑操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用，例如显微注射用的试剂等。此外，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源标记基因，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白，右臂后连接另一个外源标记基因，可指示为非基因置换而为外源基因插入的负向标记基因；/n(2)构建同源修复的敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左右臂中的核酸酶识别位点均破坏，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；/n(3)利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。/n

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源标记基因，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白，右臂后连接另一个外源标记基因，可指示为非基因置换而为外源基因插入的负向标记基因；
(2)构建同源修复的敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左右臂中的核酸酶识别位点均破坏，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；
(3)利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。


2.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的同一基因为斑马鱼gfap基因，左臂中的核酸酶靶点为gttaagtttacttaatcggg，右臂中的核酸酶靶点为ggaatgatggatttggtcag，所述的同源臂序列如SEQIDNO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：1中第1120-1821位所示；所述的正向外源标记基因为P2A-EGFP序列如SEQIDNO：1中的第331-1113位所示；所述的反向外源标记基因为IRES2-tdTomato-pA序列如SEQIDNO：1中的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾珊烨，
申请(专利权)人：南京歆佳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32