一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的且含有正向标记基因的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，并在右臂后插入负向标记基因；(2)在上述敲入质粒的基础上建立同源修复的敲入质粒；(3)利用显微注射将敲入质粒和核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。本发明专利技术可实现比较非同源末端连接和同源修复的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法。
技术介绍
目前斑马鱼基因编辑领域内缺乏比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率比较的精准方法。斑马鱼gfap基因(胶质纤维酸性蛋白)是斑马鱼胶质细胞中特异表达的基因。斑马鱼中，由于gfap基因表达的时间点、表达强度以及细胞数量较多，且胶质细胞的形态相对特异，易于观察和统计分析，因此通过gfap基因的敲入能够很好的在活体条件下分析不同置换方法效率的比较。目前，在斑马鱼中缺乏比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可在斑马鱼中比较同源修复和非同源修复末端连接实现基因置换效率的方法。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：本专利技术的一种斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源标记基因，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白，右臂后连接另一个外源标记基因，可指示为非基因置换而为外源基因插入的负向标记基因；/n(2)构建同源修复的敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左右臂中的核酸酶识别位点均破坏，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；/n(...

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼中比较同源修复和非同源末端连接实现基因置换效率的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在同一基因中寻找两个核酸酶的特异识别位点；构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左边和右边的同源臂中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源标记基因，可指示正确的敲入正向标记荧光蛋白，右臂后连接另一个外源标记基因，可指示为非基因置换而为外源基因插入的负向标记基因；
(2)构建同源修复的敲入质粒(结构与非同源末端连接的敲入质粒类似)，其中左右臂中的核酸酶识别位点均破坏，从而导致不能通过非同源末端连接的方式插入；
(3)利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中，将注射的受精卵培养幼鱼，在特定时间点观察根据不同标记基因的表达情况，比较分析其不同质粒的基因置换效率。


2.根据权利要求1所述的斑马鱼中比较同源修复和非同源修复实现基因置换效率的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的同一基因为斑马鱼gfap基因，左臂中的核酸酶靶点为gttaagtttacttaatcggg，右臂中的核酸酶靶点为ggaatgatggatttggtcag，所述的同源臂序列如SEQIDNO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：1中第1120-1821位所示；所述的正向外源标记基因为P2A-EGFP序列如SEQIDNO：1中的第331-1113位所示；所述的反向外源标记基因为IRES2-tdTomato-pA序列如SEQIDNO：1中的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾珊烨，
申请(专利权)人：南京歆佳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32