【技术实现步骤摘要】
一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法
本专利技术涉及基因
，具体涉及改造基因组的构建物及改造方法。
技术介绍
斑马鱼是生命科学研究重要模式动物之一。与人类相比，斑马鱼的组织器官具有较高的保守性和代表性。同时，斑马鱼体型较小且幼鱼透明，在目前实验室技术条件下，可方便的实现动态地观察组织器官发育和各种生理活动。为充分发挥斑马鱼在研究上的诸多优势，需要建立针对其基因的多种操作方法，制备基因功能缺失的突变体或将外源基因导入到特定的基因位点中。目前，在斑马鱼中，产生基因功能缺失的方法已成熟，并已经被广泛应用。然而，定向敲入外源基因的转基因技术还很不成熟，尤其是制备各种点突变或条件性敲除，这是目前制约斑马鱼研究领域发展的瓶颈之一。目前，定向敲入外源基因的方法主要有两种。一种是通过同源重组的方式来实现的。这种方法往往构建的效率比较低，应用上有时会借助于指示正确重组的报告基因的筛选，这使得许多定向敲入的要求不能达到。另一种是通过非同源重组的方法定向插入一段基因。这种方法往往在插入的同时带入了一些多余的核苷酸序列，...
【技术保护点】
1.一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)以基因组中目的基因的内含子、外显子、顺式作用元件和非翻译区段UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；/n(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；/n(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DN...
【技术特征摘要】
1.一种以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以基因组中目的基因的内含子、外显子、顺式作用元件和非翻译区段UTR作为目标区段，在目标区段两侧各确定一个导向RNA靶序列；针对目标区段确定基因组中的左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列和右同源臂序列中均包含各自的导向RNA靶序列；
(2)制备置换供体质粒或供体DNA片段，其包括以下顺序性连接的元件：左同源臂序列、中间的外源置换序列、右同源臂序列；
(3)将供体质粒或供体DNA片段、2个导向RNA或能形成所述2个导向RNA的DNA、Cas9蛋白或能形成Cas9蛋白的mRNA或DNA共同导入靶细胞中，获得以外源DNA通过非同源整合方式置换基因组中目标区段的基因编辑细胞。
2.根据权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标区段为目的基因任意一段；在步骤(3)中，所述的靶细胞为斑马鱼细胞，或所述的基因组为斑马鱼的基因组；根据目的基因的目标区段和导向RNA靶序列确定左同源臂序列，左同源臂序列为紧挨目标区段的5’上游基因组序列并含有左侧导向RNA靶序列，右同源臂序列为紧挨目标区段的下游基因组序列并含有右侧导向RNA靶序列，所述的外源DNA包括表达标签基因序列、报告基因、结构基因、功能基因或重组酶识别序列。
3.根据权利要求1所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的左同源臂中左侧导向RNA靶序列的5’端序列长度大于50个核苷酸，所述的右同源臂中右侧导向RNA靶序列的3’端序列长度大于50个核苷酸；在步骤(1)中，所述的目标的基因为胶质纤维酸蛋白基因或酪氨酸羟化酶基因。
4.根据权利要求3所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标基因为胶质纤维酸蛋白基因，靶序列分别为GTTAAGTTTACTTAATCGGG和GGAATGATGGATTTGGTCAG，所述的同源臂序列如SQRIDNO：1中第7-330位所示；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：1中第1120-2445位所示；所述的外源基因为P2A-EGFP序列如SEQIDNO：1中的第331-1113位所示。
5.根据权利要求3所述的以非同源性末端连接的方式置换内源基因片段的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目标基因为酪氨酸羟化酶基因，靶序列分别为GGGTTGTTACACTCATAAAG和GAATTAAGCCAACACATTCA；所述的左同源臂序列如SEQIDNO：2中第414-1695为所示；所述的右同源臂序列如SEQIDNO：2中第253...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾珊烨，
申请(专利权)人：南京歆佳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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