一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法技术

本发明专利技术公开了一种斑马鱼中条件性诱导用于研究kdrl(vegfr2)基因在血管生长研究的方法，包括如下步骤：(1)利用非同源末端连制备kdrl条件性敲除品系；(2)利用标记血管内皮细胞的转基因品系与kdrl条件性敲除品系杂交，建立双转基因品系；(3)Cre mRNA注射至上述双转基因品系内交产生的胚胎中实现kdrl敲除，并通过荧光观察和评价血管生长的异常。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法。
技术介绍
斑马鱼kdrl基因(血管生长因子受体2，vegfr2，又称flk1)对于血管发育非常重要。针对kdrl基因，目前利用该基因的启动子可以特异标记血管内皮细胞，说明该基因特异在血管内皮细胞中表达。通过该基因的突变品系研究，也同样表明kdrl对血管生长的重要性(见参考文献1和2)。目前，缺乏一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过针对kdrl基因的操作结合标记血管内皮细胞的转基因品系，在斑马鱼中实现条件性诱导kdrl敲除来研究血管生长的方法。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：本专利技术利用非同源末端连接制备的条件性敲除kdrl的斑马鱼品系，并通过标记血管内皮细胞的转基因品系和Cre系统在活体上研究血管的生长和发育，包括如下步骤：(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂的核苷酸序列和左同源臂的核苷酸序列中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因序列，包括第12个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认kdrl条件性敲除斑马鱼；(3)利用标记斑马鱼血管内皮细胞的转基因品系与上述条件性敲除品系杂交，通过荧光筛选获得双转基因品系；(4)将CremRNA注射至上述的双转基因内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定kdrl的删除、整体表型观察和血管生长的表型观察。进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。进一步地，在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，kdrl敲入质粒。更进一步地，在步骤(2)中，sgRNA1的靶点序列为：Gtaaacagtctgtgaacccc；sgRNA2的靶点序列为：Gtgagaggggtacagtacgg。进一步地，在步骤(2)中，所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO：1中的第7-692位所示，所述的右同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO：1中的第2577-3873位所示，所述的右臂之间含有需要置换的外源基因序列如SEQIDNO：1中的第693-2576位所示。进一步地，在步骤(2)中，所述的构建非同源末端连接的敲入质粒的左同源臂、右同源臂，以斑马鱼基因组为模板，并在PCR引物加入酶切位点和保护碱基扩增获得；第四个外显子两个loxP位点间的序列，以斑马鱼基因组为模板，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-kdrl_exon12-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基；可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白序列，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-myl7-DsRed-pA-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。更进一步地，在步骤(2)中，敲入供体质粒，并注射斑马鱼受精卵，筛选获得tcf3a的条件性敲入品系。进一步地，在步骤(3)中，所述的标记血管内皮细胞的斑马鱼品系为Tg(flk1：EGFP)。有益效果：本方法可活体且条件性研究血管生长。本专利技术通过制备的kdrl条件性敲除斑马鱼，并结合特异标记血管内皮细胞的转基因斑马鱼，可很好的在活体实现条件性诱导后kdrl敲除来研究血管生长的方法。本专利技术具有如下优点:(1)本专利技术提供的方法应用于研究斑马鱼血管生长和发育时，可在不同时间诱导kdrl基因的敲除，可研究不同发育阶段中kdrl在肌血管生长和发育中的作用，是诱导型基因敲除技术应用于斑马鱼血管研究的最新方法。(2)本专利技术利用斑马鱼活体模型并通过荧光蛋白标记的方法观察肌血管内皮细胞的生长和发育。附图说明为了易于说明，本专利技术由下述的具体实施例及附图作以详细描述：图1为本专利技术利用非同源重组介导的双loxP位点整合到斑马鱼kdrl基因中的示意图；斑马鱼kdrl基因对早期发育阶段的血管网络形成起着重要作用(参考文献)。sgRNA1和sgRNA2靶分别由红色或蓝色箭头指示。在kdrl条件供体(kdrl-loxP-exon12-frt-SM-frt-loxP)中，添加了两个loxP位点和同源臂(带有双箭头的棕线)。左臂和右臂的长度分别为686bps和1297bps。为了减少密集筛选条件等位基因的工作，选择标记(SM，1.2kb)可以在myl7启动子的控制下表达DsRed，其转录方向与tcf3a转录方向相反。SM也位于frt重组位点的侧面，因此可以通过Flp重组酶切除。斑马鱼kdrl有30个外显子，E12(第12个外显子)含有109bps。将供体与sgRNA1，sgRNA2和zCas9mRNA共同注射后，内源性E12在kdrl位点被kdrl-loxP-exon12-frt-SM-frt-loxP所替代。黑色短箭头表示用于验证的引物(F1，R1，F2，R2)。图2为本专利技术的kdrl条件性敲除品系在flp、CremRNA注射后的PCR和表型鉴定；(C)在单细胞阶段注射flpmRNA至kdrl条件性敲除品系的杂合子胚胎中，3dpf时PCR鉴定SM的缺失。(D)在单细胞阶段不注射(“-Cre”)或注射(“+Cre”)CremRNA至杂合子Ki(kdrlf1)内交产生的子代，3dpf时PCR鉴定kdrl第12个外显子的缺失。红色箭头表示处的其他产物，原则上由Cre从原始片段中切除获得。(E和F)3dpf大的双转基因[Tg(kdrl：EGFP)；Ki(kdrlfl/+)]内交产生的幼鱼的明场(上图)和共聚焦(下图)图像。在单细胞阶段CremRNA注射或未注射，表明CremRNA注射会导致心脏DsRed表达缺失(E1中的插图)以及躯干(E2)和脑部(E3)的血管缺陷。比例尺：250μm(E1，F1)，100μm(E2，E3，F2，F3)。具体实施方式通过以下实施例进一步详细说明本专利技术，但应注意本专利技术的范围并不受这些实施例的任何限制。本专利技术利用非同源末端连接制备的条件性敲除kdrl的斑马鱼品系，并通过标记血管内皮细胞的转基因品系和Cre系统在活体上研究血管的生长和发育，包括如下步骤：(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；/n(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂序列和左同源臂序列中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因的核苷酸序列，包括第12个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认kdrl条件性敲除斑马鱼；/n(3)利用标记斑马鱼血管内皮细胞的转基因品系与上述条件性敲除品系杂交，通过荧光筛选获得双转基因品系；/n(4)将Cre mRNA注射至上述的双转基因内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定kdrl的删除、整体表型观察和血管生长的表型观察。/n

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；
(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂序列和左同源臂序列中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因的核苷酸序列，包括第12个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认kdrl条件性敲除斑马鱼；
(3)利用标记斑马鱼血管内皮细胞的转基因品系与上述条件性敲除品系杂交，通过荧光筛选获得双转基因品系；
(4)将CremRNA注射至上述的双转基因内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定kdrl的删除、整体表型观察和血管生长的表型观察。


2.根据权利要求1所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。


3.根据权利要求1所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，kdrl敲入质粒。


4.根据权利要求3所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，sgRNA1的靶点序列为：Gtaaacagtctgtga...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾珊烨，
申请(专利权)人：南京歆佳医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32