敲除载体、打靶载体、试剂盒、Prdm16检测用动物模型、检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种敲除载体，包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别Prdm16基因中的特定序列的sgRNA，sgRNA能够与Prdm16基因中特定序列互补配对，使Cas9酶特异地切割特定序列和特定序列的互补链，特定序列中包括Prdm16基因的终止密码子。本发明专利技术还公开了一种打靶载体，所述打靶载体与所述的敲除载体配合使用以在所述Cas9酶的切割位点处插入标记基因。本发明专利技术还公开了一种Prdm16基因表达量检测试剂盒。本发明专利技术还公开了一种敲入有荧光素酶基因的Prdm16表达量检测用非人哺乳动物模型。本发明专利技术还公开了一种Prdm16表达量检测方法。本发明专利技术还公开了一种所述非人哺乳动物模型的应用。

【技术实现步骤摘要】
敲除载体、打靶载体、试剂盒、Prdm16检测用动物模型、检测方法及应用
本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种敲除载体、打靶载体、试剂盒、Prdm16检测用动物模型、检测方法及应用。
技术介绍
肥胖作为人类疾病的第六位危险因素，不仅降低生活质量，更是诱发心血管疾病、Ⅱ型糖尿病乃至癌症等慢性疾病的罪魁祸首。肥胖主要是由于机体能量的长期摄入大于消耗，多余的能量以甘油三酯的形式储存在脂肪组织中而导致。脂肪组织主要分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪细胞仅包含一个大脂滴，其主要功能是将能量以三酰甘油的形式储存于大脂滴中，同时分泌各种不同的内分泌激素来调节人体能量平衡。而棕色脂肪细胞氧供丰富且受交感神经支配，不仅包含许多小脂滴，且其细胞内还有许多细胞质、细胞器和多嵴的线粒体，细胞质内含有许多细胞色素，棕色脂肪细胞线粒体内膜上特异性表达解偶联蛋白1，解偶联蛋白1可以跨过线粒体内膜运输质子，破坏氧化磷酸化，而机体对ATP的需求迫使更多脂肪分解，实现非颤抖性产热。然而，棕色脂肪组织在成人体内含量很低，正常情况下对能量消耗的作用有限。近期研究发现，在寒冷、运动刺激或β3肾上腺素受体激动剂作用下，白色脂肪组织中解偶联蛋白1阳性脂肪细胞数量会明显增加，现已证实此类细胞呼吸速率较典型的棕色脂肪细胞高，被称为“米色脂肪细胞”，来源于白色脂肪细胞的转化，因此将这一过程被称作“白色脂肪棕色化”。近些年来众多的研究证实，白色脂肪棕色化能够提高机体的能量代谢，改善肥胖机体的胰岛素抵抗，达到降低体脂，减轻体重效果。在众多的转录因子中，Prdm16不仅是棕色和米色脂肪细胞定向分化的决定基因，也是产热程序启动与调控骨骼肌和棕色脂肪细胞分化的“开关基因”。在肌前体细胞中，Prdm16高表达可通过诱导棕色脂肪分化特征基因大量表达，抑制成肌因子表达，从而诱导其向棕色脂肪转化；同样，在3T3-L1等白色脂肪前体细胞中高表达Prdm16可呈现出米色脂肪表型。近年来，虽然对Prdm16在脂肪分化方面已经有了深入的研究，但对Prdm16表达量的研究还非常少，且研究手段主要是实时定量PCR或者Westernblot，这两种方法都费时费事费力费钱。实时定量PCR至少需要一天的时间来检测Prdm16的表达，而Westernblot至少需要两天的时间来进行检测分析，目前Westernblot方法中也没有高特异性的抗体用于Prdm16的检测。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种快捷、准确地检测Prdm16表达量的敲除载体、打靶载体、试剂盒、Prdm16检测用动物模型、检测方法及应用。一种敲除载体，所述敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到所述CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；所述CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；所述互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别Prdm16基因中的特定序列的sgRNA，所述sgRNA能够与所述Prdm16基因中所述特定序列的互补链互补配对，使所述Cas9酶特异地切割所述特定序列和所述特定序列的互补链，所述特定序列中包括所述Prdm16基因的终止密码子。在其中一个实施例中，所述特定序列的互补链选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中的一种或多种。在其中一个实施例中，所述Cas9酶的切割位点位于所述终止密码子的上游。一种打靶载体，所述打靶载体与所述的敲除载体配合使用以在所述Cas9酶的切割位点处插入标记基因，所述打靶载体包括依次连接的5’同源基因、标记基因以及3’同源基因，所述5’同源基因与含有所述Prdm16基因的染色体上的所述切割位点的上游端相邻基因的序列同源，所述3’同源基因与所述含有所述PRDM16基因的染色体上的所述切割位点的下游端相邻基因的序列同源，所述标记基因包括荧光素酶基因。在其中一个实施例中，所述标记基因还包括flag标签蛋白基因以及所述flag标签蛋白基因和所述荧光素酶基因之间的连接的2A肽基因。在其中一个实施例中，所述打靶载体还包括正筛选基因和负筛选基因，所述正筛选基因设置在所述标记基因段，所述负筛选基因与所述3’同源基因的3’端连接，所述正筛选基因选自PGK-Neo-polyA基因，所述负筛选基因选自MC1-TK-polyA基因。一种Prdm16基因表达量检测试剂盒，包括所述的敲除载体和所述的打靶载体。一种敲入有荧光素酶基因的Prdm16表达量检测用非人哺乳动物模型，使用所述的Prdm16基因表达量检测试剂盒，并通过以下步骤制备得到：将所述敲除载体和所述打靶载体共同转染到胚胎干细胞；对所述转染后的胚胎干细胞筛选得到阳性胚胎干细胞；以及将所述阳性胚胎干细胞注射入非人哺乳动物的囊胚中。一种所述的非人哺乳动物模型中的Prdm16表达量的检测方法，包括：取所述非人哺乳动物模型的特定组织或特定细胞，使用荧光照度计检测所述特定组织或所述特定细胞的荧光发光信号；或者使用荧光成像仪对所述非人哺乳动物模型进行活体成像。一种所述的非人哺乳动物模型的应用，所述非人哺乳动物模型用于筛选调控Prdm16表达量的药物。本专利技术采用CRISPR/Cas9基因敲除系统对Prdm16基因的终止密码子上游基因进行切割，然后通过打靶载体将包括荧光素酶基因的标记基因敲入所述切割位点，从而通过所述荧光素酶基因的表达量变化表征所述Prdm16基因的表达量变化。与现有的采用转基因的方法将检测基因的启动子加上荧光素酶基因随机插入到基因组中而构建得到的荧光素酶基因检测模型相比，本专利技术的通过sgRNA和Cas9酶的切割方式能够实现定点切割，得到预定的切割位点，通过与敲除载体基因配合使用的打靶载体能够将荧光素酶基因准确插入所述切割位点，从而能够准确反映Prdm16基因的表达量变化。本专利技术构建的敲入有荧光素酶基因的Prdm16表达量检测用非人哺乳动物模型可作为调控Prdm16表达的药物的筛选平台，相比较现有的其它方法，本专利技术的非人哺乳动物模型可实现简单、迅速、大规模地筛选调控Prdm16表达的药物。本专利技术的非人哺乳动物模型只需要两个小时即可以完成一个24孔板的筛选。并且本专利技术构建的敲入有荧光素酶基因的Prdm16表达量检测用非人哺乳动物模型可以在不伤害非人哺乳动物的前提下，利用荧光成像仪直接活体检测非人哺乳动物中Prdm16的表达和分布，从而可准确的反映表达Prdm16的组织部位。附图说明图1为本专利技术一实施例的敲入有荧光素酶基因的Prdm16表达量检测用非人哺乳动物模型的制备方法；图2为本专利技术一实施例的Prdm16在各个组织的表达量检测结果照片；图3为本专利技术一实施例的检测药物对Prdm16表达量的影响结果照片；图4为本专利技术一实施例的小鼠活体成像检测结果照片。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本专利技术的敲除载体、打靶载体、试剂盒、Prdm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除载体，其特征在于，所述敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到所述CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；/n所述CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；/n所述互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别Prdm16基因中的特定序列的sgRNA，所述sgRNA能够与所述Prdm16基因中所述特定序列的互补链互补配对，使所述Cas9酶特异地切割所述特定序列和所述特定序列的互补链，所述特定序列中包括所述Prdm16基因的终止密码子。/n

【技术特征摘要】
1.一种敲除载体，其特征在于，所述敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到所述CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；
所述CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；
所述互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别Prdm16基因中的特定序列的sgRNA，所述sgRNA能够与所述Prdm16基因中所述特定序列的互补链互补配对，使所述Cas9酶特异地切割所述特定序列和所述特定序列的互补链，所述特定序列中包括所述Prdm16基因的终止密码子。


2.根据权利要求1所述的敲除载体，其特征在于，所述特定序列的互补链选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中的一种或多种。


3.根据权利要求2所述的敲除载体，其特征在于，所述Cas9酶的切割位点位于所述终止密码子的上游。


4.一种打靶载体，其特征在于，所述打靶载体与根据权利要求1-3任一项所述的敲除载体配合使用以在所述Cas9酶的切割位点处插入标记基因，所述打靶载体包括依次连接的5’同源基因、标记基因以及3’同源基因，所述5’同源基因与含有所述Prdm16基因的染色体上的所述切割位点的上游端相邻基因的序列同源，所述3’同源基因与所述含有所述PRDM16基因的染色体上的所述切割位点的下游端相邻基因的序列同源，所述标记基因包括荧光素酶基因。


5.根据权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述标记基因还包括flag标签蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东海，聂涛，张羽薇，赵世亭，惠晓艳，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44