一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种减少CRISPR‑Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。所述方法包括如下步骤：使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA，再将所述双链DNA与CRISPR‑Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中；其中，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶，所得双链DNA具有同向突出但是不能互补配对的粘性末端或者非同向突出的粘性末端，且粘性末端在体内被抹平的难度较大，因此该方法能够明显减少CRISPR‑Cas9基因编辑中双链DNA片段的串联率。

【技术实现步骤摘要】
一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，涉及一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。
技术介绍
非同源末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination，HR)是DNA双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)的两种修复方式。其中，NHEJ通过DNA连接酶将DSBs末端直接链接，不依赖于同源DNA序列。Ku蛋白(Ku70/Ku80)复合物识别结合到DSBs末端，Ku-DNA复合物招募DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)激活其激酶活性，将自身磷酸化启动NHEJ通路，吸引重组酶Artemis加入处理DNA末端，然后召集XRCC4-DNAligase4-XLF复合物促使DNA末端进行连接。NHEJ修复迅速高效，但是可能造成一些序列缺失，同时也会造成一些片段的插入，不够精确。HR需要以未受伤的姐妹染色单体的同源序列作为修复的模板。M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中；/n其中，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
使用限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到双链DNA，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中；
其中，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的温度为36.5～37.5℃，优选为37℃；
优选地，所述酶切的时间为4～8h；
优选地，所述限制性内切酶I的工作浓度为0.3～1U/μL；
优选地，所述限制性内切酶II的工作浓度为0.3～1U/μL。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2～10ng/μL；
优选地，所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和cas9mRNA。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的工作浓度为2～8ng/μL；
优选地，所述Cas9mRNA的工作浓度为5～15ng/μL。


5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′；
或者，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′。


6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金龙，朱石磊，林梓凡，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32