一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用。本发明专利技术选择与小鼠对应的PCSK9‑201转录本的CDS(NM_174936.4)在小鼠上进行人源基因的替换。通过打靶载体的设计、构建和纯化，体外转录，Cas9/sgRNA的显微注射，F0小鼠的鉴定及可遗传性检测等步骤，获得阳性F1代小鼠。并对hPCSK9小鼠中人源PCSK9的表达以及血脂水平进行验证，表明按本申请方法构建的hPCSK9小鼠，能够成功良好地表达人源PCSK9蛋白，并且在本底状态下血液中LDL‑C水平正常，可以作为一种人源化动物模型进行高血脂症疾病模型的诱导，应用于靶向PCSK9人源抗体或药物的筛选和药效评价。

【技术实现步骤摘要】
一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的PCSK9基因修饰人源化动物模型的构建方法。
技术介绍
据世界卫生组织统计，全球每年有1790万人死于心血管疾病，心血管疾病仍然人类疾病致死的首要因素，高于肿瘤和其他疾病。中国的心血管疾病的患病率也处于持续上升的阶段，据《中国心血管病报告2017》显示，我国的心血管病患者约2.9亿，2015年每5例死亡中就有2例死于心血管疾病。血脂异常是引起动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素之一。2002年CHNS、2010年中国慢性肾病工作组调查和《中国居民营养与慢性病状况调查(2015年)》显示，我国成人血脂异常的患病率分别为18.6％、34.0％和40.4％，10年间中国成人血脂异常患病率大幅上升，这与我国心血管疾病的发病增加关系密切。因此，降血脂药物的开发对于降低我国心血管疾病的发生和致死率都具有极其重要的意义。血脂的重要组分胆固醇参与细胞膜的形成并调节其流动性，此外还是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的重要前体。然而血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，将人源PCSK9-201转录本的CDS及polyA元件全片段替换在小鼠PCSK9-201基因的对应片段，所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段为SEQ ID NO：1；并且所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段在小鼠PCSK9-201转录本ENSMUST00000049507.5的翻译起始位点开始全片段替换；人源PCSK9在内源小鼠PCSK9基因的调控下表达；所述polyA元件的插入长度约为2.9kb；具体包括如下步骤：/n(1)打靶载体的设计、构建和纯化：包括设计sgRNA，采用巢式PCR、测序检测sgRNA的活...

【技术特征摘要】
1.一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，将人源PCSK9-201转录本的CDS及polyA元件全片段替换在小鼠PCSK9-201基因的对应片段，所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段为SEQIDNO：1；并且所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段在小鼠PCSK9-201转录本ENSMUST00000049507.5的翻译起始位点开始全片段替换；人源PCSK9在内源小鼠PCSK9基因的调控下表达；所述polyA元件的插入长度约为2.9kb；具体包括如下步骤：
(1)打靶载体的设计、构建和纯化：包括设计sgRNA，采用巢式PCR、测序检测sgRNA的活性，构建sgRNA表达载体，构建携带靶位点同源臂及插入序列的Donorvector，将Donorvector转化到DH5a感受态细胞中，扩大培养后提取质粒并纯化，获得donor片段产物；
(2)体外转录：体外转录合成Cas9mRNA以及sgRNA；
(3)Cas9/sgRNA的显微注射：将步骤(2)体外转录合成的Cas9mRNA、sgRNA和步骤(1)获得的donor片段混合并调整浓度，显微注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕的母鼠输卵管中，等待F0代小鼠出生；
(4)F0代小鼠的鉴定及可遗传性检测；
步骤(1)中，sgRNA序列为SEQIDNO：2；且PAM序列为：GGG；在采用巢式PCR、测序检测sgRNA的活性中，采用的out引物对为GPT000208-HPCSK9-S-OutF1：SEQIDNO：3，GPT000208-HPCSK9-S-OutR1：SEQIDNO：4；int引物对为GPT000208-HPCSK9-S-intF1：SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，赵静，陈中，杨笑柳，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32