利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。体外转录获得CRISPR/Cas9系统，采用两个sgRNA共同打靶同一目的基因的原则进行山羊受精卵显微注射；奶山羊进行同期发情与超数排卵处理后，在母羊最后一次接受交配后的8‑12小时，即发情开始后约46‑50小时进行冲胚，获得原核期受精卵，并置于含有10％胎牛血清的M199培养液中进行显微注射；本发明专利技术提高了SCD1基因编辑山羊胚胎的发育率及基因编辑效率，具有良好的推广应用前景和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法
本专利技术属于基因工程和遗传修饰领域，涉及利用CRISPR/Cas9系统与显微注射技术建立的山羊胚胎高效基因编辑方法。
技术介绍
奶山羊产业是现代奶业的重要组成部分，山羊乳制品营养含量高，富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸，具有独特的营养价值和保健功能(ClarkandGarcia,2017)，因此，优化羊乳脂肪酸组成和含量十分必要(Mahdietal.,2018)。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)基因可催化饱和脂肪酸生成羊乳脂肪酸的重要组成部分，即单不饱和脂肪酸(Bernardetal.2005)。通过获得SCD1基因敲除山羊胚胎，可为活体动物实验奠定基础，为研究SCD1基因对羊乳脂肪酸的调控作用提供试验动物材料，具有重要意义。CRISPR/Cas9技术已成为实现转基因动物生产及分子育种的主要手段，可以高效并精确地对基因组特定位点进行缺失、插入、修复等(Watakabeetal.,2018)编辑，为定向精准改变遗传物质、调控动物遗传性状提供了有效途径。目前，CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术已被广泛应用于构建基因敲除小鼠和大鼠等动物模型，并且利用该基因编辑技术成功获得了抗结核转基因牛、抗蓝耳病猪、瘦肉猪和基因敲除绒山羊等(Gaoetal.,2017；Wangetal.,2015；吴添文等.,2017)。将显微注射技术应用于CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑，可显著提高基因编辑效率(Qinetal.,2015)，在果蝇胚胎中编辑效率可高达100％(Yuetal.，2013)，而在哺乳动物胚胎中的编辑效率则较低。为了提高编辑效率，中国专利CN106148416A将经显微注射针对Cyp基因不同亚型的sgRNA及Cas9mRNA的受精卵体外培养，并选择存活的受精卵移入受体大鼠，利用生产的大鼠后代进行交配(与野生型大鼠杂交后自交)，从而获得目的亚型敲除的纯合体大鼠，但针对繁殖周期长、繁殖力相对不足的山羊而言，由于个体差异大，难以获得足够数量的同质性高、质量佳的受精卵。同样为了提高编辑效率，中国专利CN106957857A将针对山羊MSTN基因和FGF5基因各自不同或相同外显子区设计的两个sgRNA及Cas9mRNA进行原核注射以降低脱靶率，但哺乳动物胚胎发育时期的基因表达调控通路复杂，而打靶位点的增加，使得利用CRISPR/Cas9系统与显微注射生产转基因动物变得更加困难，主要存在的问题为：基因编辑胚胎发育率低，以及由此导致的后代出生率低。哺乳动物(以小鼠为例)受精卵的发育可被定义为不同的原核(PN)阶段，即PN1到PN5。在PN1和PN2期间，预复制的原核较小，在受精后定位于胚胎外围，并在G1期(受精后10h)开始向胚胎中心迁移；在PN3和PN4期间，原核进行DNA复制，在S期(受精后10-16h)进一步向中心迁移并彼此靠近；在PN5时，胚胎几乎处于G2期。基因编辑效率、注射后受精卵的损伤程度与显微注射选择的原核(PN)阶段密切相关，有研究报道小鼠胚胎在处于细胞周期的S期时，利用显微注射技术导入Cas9mRNA与sgRNA的复合物，约3h后基因编辑开始并持续12h至24h。但对于山羊而言，由于受精卵数量有限，显微注射中注入液体对受精卵产生冲击，以及注入液体量的控制难度较大等制约胚胎的存活及后期发育的因素更为突出。目前，尚无利用CRISPR/Cas9系统与显微注射对山羊胚胎进行SCD1基因编辑的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，包括以下步骤：1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9mRNA以及用于共打靶山羊SCD1基因的两个sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或将经过注射的原核期受精卵置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。优选的，所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。优选的，所述sgRNA识别的靶序列(即sgRNA的编码序列，sgRNA序列)为：5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’(山羊SCD1基因CDS的第6-25bp)5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’(山羊SCD1基因CDS的第339-358bp)。优选的，所述步骤1)还包括以下步骤：利用体外切割试验检测sgRNA的活性。优选的，所述步骤2)中，将母羊进行同期发情及超数排卵处理，然后将发情母羊与公羊交配，在发情母羊最后一次接受交配后8-12小时(即发情开始后约46-50小时)收集受精卵；利用与显微注射仪相连的显微注射针对该受精卵进行体外注射。优选的，所述显微注射仪的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa(百帕)，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-50hPa。优选的，所述显微注射针利用拉针仪拉制而成，拉制参数设置为：heat＝786-846，pull＝90-110，velocity＝140-160，time＝190-210。优选的，所述Cas9mRNA的浓度为50-100ng/μL，sgRNA的浓度为25-50ng/μL。一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，该试剂盒包括上述sgRNA的体外转录模板(构建于相应的克隆载体中)以及Cas9mRNA体外转录模板。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术利用体外转录获得的针对山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的sgRNA进行显微注射，不仅可以提供数量更多的SCD1基因编辑胚胎(囊胚)以提高后代的出生率，而且为加快产乳性能优良的奶山羊的育种进程提供了可靠的技术依据，具有很好的推广应用前景和经济价值。进一步的，本专利技术对获得的处于一定原核阶段的山羊胚胎按照优化的显微注射参数进行注射，并利用拉针仪制成的显微注射针(其口径不超过1μm)精确控制(根据注射参数)受精卵的液体注入量(1-2pL)，从而可最大限度地保证注射后胚胎的存活率。进一步的，本专利技术将针对山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子的sgRNA与Cas9基因的体外转录产物一并进行显微注射，可获得较高的山羊胚胎SCD1基因编辑效率和基因编辑胚胎(囊胚)的发育率。附图说明图1为定位于山羊26号染色体的(Chr.26)SCD1基因(SCD1locus)sgRNA设计示意图。图2为山羊sgRNA体外转录电泳图；其中：9代表sgRNA9的泳道，16代表sgRNA16的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；/n2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；
2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。


3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列为：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
及
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。


4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述步骤2)中，对发情母羊最后一次接受交配后8-12小时或发情开始后46-50小时收集的受精卵进行体外注射。


5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：田慧彬，牛慧敏，罗军，姚玮玮，李聪，耿亚楠，雷安民，史怀平，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61