利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。体外转录获得CRISPR/Cas9系统，采用两个sgRNA共同打靶同一目的基因的原则进行山羊受精卵显微注射；奶山羊进行同期发情与超数排卵处理后，在母羊最后一次接受交配后的8‑12小时，即发情开始后约46‑50小时进行冲胚，获得原核期受精卵，并置于含有10％胎牛血清的M199培养液中进行显微注射；本发明专利技术提高了SCD1基因编辑山羊胚胎的发育率及基因编辑效率，具有良好的推广应用前景和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法
本专利技术属于基因工程和遗传修饰领域，涉及利用CRISPR/Cas9系统与显微注射技术建立的山羊胚胎高效基因编辑方法。
技术介绍
奶山羊产业是现代奶业的重要组成部分，山羊乳制品营养含量高，富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸，具有独特的营养价值和保健功能(ClarkandGarcia,2017)，因此，优化羊乳脂肪酸组成和含量十分必要(Mahdietal.,2018)。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)基因可催化饱和脂肪酸生成羊乳脂肪酸的重要组成部分，即单不饱和脂肪酸(Bernardetal.2005)。通过获得SCD1基因敲除山羊胚胎，可为活体动物实验奠定基础，为研究SCD1基因对羊乳脂肪酸的调控作用提供试验动物材料，具有重要意义。CRISPR/Cas9技术已成为实现转基因动物生产及分子育种的主要手段，可以高效并精确地对基因组特定位点进行缺失、插入、修复等(Watakabeetal.,2018)编辑，为定向精准改变遗传物质、调控动物遗传性状提供了有效途本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；/n2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；
2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。


3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列为：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
及
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。


4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述步骤2)中，对发情母羊最后一次接受交配后8-12小时或发情开始后46-50小时收集的受精卵进行体外注射。


5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：田慧彬，牛慧敏，罗军，姚玮玮，李聪，耿亚楠，雷安民，史怀平，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61