一种环状RNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环状RNA及其应用，该环状RNA的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，环状RNA的结构为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。本发明专利技术通过QPCR检测肝癌组织和癌旁组织中circDLC1的表达差异情况，发现circDLC1在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织，表明circDLC1能够用于肝癌诊断，通过迁移与侵袭实验可证实，circDLC1过表达后肝癌细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制，表明circDLC1能够作为治疗靶点应用于肝细胞癌的诊断和治疗；通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位模型和裸鼠晚期肺转移模型，证实了circDLC1过表达对裸鼠体内肝癌细胞增殖、侵袭和转移具有抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种环状RNA，包含该环状RNA的试剂盒、药物组合物，以及该环状RNA作为治疗靶点在肝细胞癌诊断和治疗中的应用。
技术介绍
肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是肝癌的主要形式，约占原发性肝癌的90％。肝癌术后复发和转移是预后不良的主要原因，其五年生存率低于20％。环状RNA(circRNAs)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，且以共价键形成的环形结构的非编码RNA。由于环状RNA呈封闭式的环状结构，不易被RNaseR酶消化，相较于线性RNA能够更稳定地存在于生物体中。越来越多的研究证明环状RNA在许多类型的癌症中存在异常表达且发挥重要作用。但环状RNA在肝癌中的作用知之甚少，因此有必要针对肝细胞癌的环状RNA进行深入研究，筛选出能够作为治疗靶点以实现肝细胞癌诊断、治疗的环状RNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于专利技术人对circDLC1在肝癌细胞生长和转移中的功能和机制研究，提供一种环状RNA，包含该环状RNA的试剂盒、药物组合物，以及环状RNA作为治疗靶点在肝细胞癌的诊断和治疗中的应用。本专利技术通过下述技术方案实现：一种环状RNA，所述环状RNA的cDNA序列如SEQIDNO：1所示，环状RNA的结构为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。circDLC1(CircBaseID:hsa_circ_0135718)包含DLC1基因的第14至第16个外显子，其环化的核苷酸序列有552个碱基，目前尚未有任何关于circDLC1功能的报道。circDLC1对应的cDNA序列如SEQIDNO：1所示，circDLC1的序列如SEQIDNO：2所示。circDLC1的结构为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。专利技术人通过实验研究发现，circDLC1是一种受KIAA1429调控的环状RNA。KIAA1429是N6-甲基腺苷(m6A)甲基转移酶复合物的重要组分，且已被证明能够通过增强肝癌中m6A甲基化水平促进肝细胞癌的发生发展。通过在华西医院肝癌患者的肿瘤组织中验证发现circDLC1在癌组织中的表达明显低于癌旁组织，提示其在肝癌的发生发展中可能发挥重要作用。此外，通过体外实验发现，过表达的circDLC1能够抑制肝癌细胞增殖、迁移与侵袭。体内实验发现，过表达circDLC1后可以抑制肿瘤的生长、肝内转移和肺转移。专利技术人通过机理研究发现，circDLC1能够与RNA结合蛋白HuR结合，从而减少HuR与MMP1mRNAs的相互作用，进而抑制MMP1的表达。结合以上实验结果及机理研究，证实了circDLC1在肝癌的生长与转移中发挥至关重要的作用，因此可作为治疗肝癌的潜在的药物作用靶点。基于上述circDLC1的研究，本专利技术提供一种用于诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括定量检测环状RNAhsa_circ_0135718的试剂。进一步地，所述试剂包括能够扩增所述环状RNA的引物。作为本专利技术中用于扩增circDLC1的引物的优选实施方案，所述引物包括如下引物对：F：5'-TCGAGACTACGTTGTTTTAAGGGTA-3'(SEQIDNO：3)R：5'-AGGGGCTTCAGCTCTTGTTC-3'(SEQIDNO：4)进一步地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和逆转录反应体系。所述RNA提取试剂为Trizol试剂，所述逆转录反应体系包括逆转录酶、缓冲液、RNase抑制剂、Oligo、dNTPs等。本专利技术还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括环状RNAhsa_circ_0135718和/或增加所述环状RNA的表达量的试剂，以及药物学上可接受的载体。本专利技术进一步提供上述任一种药物组合物在制备用于抑制肝癌细胞增殖、迁移的药物或治疗肝癌的药物中的应用。本专利技术还提供上述环状RNA在制备肝癌诊断试剂盒中的用途。本专利技术还提供上述环状RNA在制备或筛选治疗肝癌的药物中的用途。本专利技术还提供增加上述环状RNA的表达量的试剂在制备治疗肝癌的药物中的用途。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本专利技术设计了能够扩增circDLC1的特异性引物，利用该引物进行扩增得到环状RNAcircDLC1后，通过一代测序证实了circDLC1的拼接位点，并结合RNaseR消化实验证实了circDLC1为具有闭合环状结构的环状RNA分子；2、本专利技术通过QPCR检测肝癌组织和癌旁组织中circDLC1的表达差异情况，发现circDLC1在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织，表明circDLC1能够用于肝癌诊断；3、本专利技术通过将circDLC1构建到环状RNA专用的慢病毒载体上，以建立过表达该基因的稳定细胞株，通过CCK8增殖实验发现在circDLC1过表达后，肝癌细胞增殖能力受到明显抑制，通过Transwell迁移与侵袭实验可证实，circDLC1过表达后，肝癌细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制；因此，circDLC1基因及其表达产物能够作为治疗靶点应用于肝细胞癌的治疗；4、本专利技术通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位模型和裸鼠晚期肺转移模型，检验了circDLC1过表达对裸鼠体内肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响，证明circDLC1基因及其表达产物的过表达能够在动物体内起到抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移的作用。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为本专利技术一个实施例中circDLC1的特征结构图；图2为本专利技术一个实施例中circDLC1扩增产物拼接位点的一代测序图；图3为本专利技术一个实施例中RNaseR对circDLC1和mDLC1的消化对比图；图4为本专利技术一个实施例中QPCR检测肝癌组织和癌旁组织中circDLC1的表达结果对比图；图5为本专利技术一个实施例中过表达circDLC1的肝癌细胞株与对照细胞系的细胞增殖曲线示意图，其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的450nm的吸光值；图6为本专利技术一个实施例中细胞侵袭和迁徙实验结果图；图7为本专利技术一个实施例中过表达circDLC1对裸鼠体内肝癌肿瘤增殖的影响，其中(a)为裸鼠皮下注射过表达circDLC1的肝癌细胞28天后，裸鼠皮下成瘤情况；(b)为裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线；图8为本专利技术一个实施例中过表达circDLC1对裸鼠体内肿瘤肝内转移的影响，其中(a)为荧光视野(BrightfieldFluorescence)，展示了裸鼠肝包膜下注射过表达circDLC1的肝癌细胞的肝内转移瘤结果；(b)为裸鼠肝脏转移瘤HE染色照片；(c)为肝内成瘤实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数；...

【技术保护点】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，环状RNA的结构为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA的cDNA序列如SEQIDNO：1所示，环状RNA的结构为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构。


2.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量检测如权利要求1所述的环状RNA的试剂。


3.根据权利要求2所述的一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括能够扩增所述环状RNA的引物。


4.根据权利要求3所述的一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述引物包括：
F：5'-TCGAGACTACGTTGTTTTAAGGGTA-3'(SEQIDNO：3)
R：5'-AGGGGCTTCAGCTCTTGTTC-3'(SEQIDNO：4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾勇，袁克非，刘海灵，徐琳，兰天，李慧，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51