一种增强微生物固氮能力的人工非编码RNA模块制造技术

本发明专利技术涉及利用合成生物学方法创建的人工非编码RNA模块及其在人工固氮体系构建中的用途。所述RNA模块通过与固氮酶编码基因nifHDK mRNA的相互作用，增强nifHDK mRNA转录后的稳定性，进而提高了底盘微生物的固氮能力。本发明专利技术构建了人工RNA模块的融合表达载体，并转入到不同的底盘固氮微生物中。实验证实，在固氮条件下，本发明专利技术的人工RNA模块能够显著提高重组工程菌株固氮酶活性。

An artificial non coding RNA module for enhancing microbial nitrogen fixation

【技术实现步骤摘要】
一种增强微生物固氮能力的人工非编码RNA模块
：本专利技术涉及生物
，具体涉及一种增强微生物固氮能力的人工非编码RNA模块及其在固氮合成生物学中的应用。
技术介绍
：生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的，受胞内能源供应和环境胁迫因子影响较大。为适应环境变化，固氮微生物在进化过程中形成了一套复杂的调控系统，固氮细胞需要表达和维持足够的固氮基因(nif)mRNAs分子，才能确保高效固氮酶活。天然固氮体系由于受环境影响较大，导致固氮效率低下，从而极大地限制了其在农业生产中的应用。因此利用合成生物学方法，人工设计标准化、智能化的信号响应元件及功能模块，构建高效固氮基因回路，在微生物底盘中进行适配机制研究，创制新型人工固氮体系，是提高生物固氮效率，实现其在农业广泛应用的新策略和新途径。非编码RNA(Non-codingRNA,ncRNA)是一类非常重要的转录后调节子。其通过与mRNA碱基配对，在转录后水平抑制或是激活靶基因的表达，进而在细菌不同的代谢调控过程中发挥重要的调节作用。在固氮菌中也发现了多个ncRNAs可能参与固氮基因的表达调控，其中非编码RNANfiR和NfiS分别通过与固氮酶基因nifD和nifKmRNA的相互作用协同参与固氮酶活的调控。因此，人工设计ncRNAs，利用其参与固氮酶调控的作用特性可以构建人工高效固氮体系。
技术实现思路
：本专利技术的目的是设计与合成一种人工非编码RNA模块，用于各种人工高效固氮体系构建。r>本专利技术提供了一种人工非编码RNA模块(ArtificialNitrogenaseactivity-Enhancingnon-codingRNA)，命名为AneR，由以下元件构成：(1)含有与固氮酶编码基因nifHDKmRNA互补配对区的人工RNA编码序列，其核苷酸序列由SEQIDNO:2所示(3)启动所述人工RNA编码基因转录的σ54依赖型人工启动子元件，其核苷酸序列由SEQIDNO:3所示。本专利技术的人工非编码RNA模块AneR提高底盘微生物的固氮能力的原理是：AneR通过与固氮酶编码基因nifHDKmRNA的相互作用，增强nifHDKmRNA转录后的稳定性。本专利技术构建了该人工RNA模块的表达载体pAneR，其表达受固氮条件诱导表达的人工启动子控制，将该融合载体分别转至固氮施氏假单胞菌、肺炎克氏杆菌及棕色固氮菌3株固氮微生物底盘中，获得了3个具有新型人工固氮回路的重组工程菌株。实验证实，在固氮条件下，本专利技术的人工RNA模块AneR能够显著提高多种重组工程菌株固氮酶活性。本专利技术是通过以下具体工作得到上述人工RNA功能元件模块，并证实其功能：1、人工RNA模块AneR的设计与合成根据固氮施氏假单胞菌、肺炎克氏杆菌以及棕色固氮菌中固氮酶编码基因nifHDKmRNA的序列保守性，用人工化学合成的方法合成一个具有“简并性”互补配对区的人工RNA功能模块AneR。AneR的表达受一个由特异响应固氮信号的人工启动子控制，其通过与三株菌固氮酶编码基因nifHDKmRNA的碱基互补配对，引起受抑制的二级结构解链，从而导致固氮酶基因的高效表达，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。2、构建人工RNA模块AneR的融合表达载体，将其转入三个不同的固氮微生物底盘中，获得三个重组固氮工程菌株(1)构建AneR融合表达载体将人工合成的AneR片段进行BamHI和HindIII双酶切，插入到广宿主表达载体pFLAα3的多克隆位点处，获得本专利技术人工RNA的融合表达载体pAneR(图1)；(2)获得三种重组固氮工程菌株将表达载体分别转入底盘微生物固氮施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)及棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)中，获得三种重组工程菌P.stutzeri(pAneR)、K.pneumoniae(pAneR)和A.vinelandii(pAneR)。3、重组固氮工程菌株的固氮能力分析(1)人工RNA模块AneR对固氮胁迫信号的响应分析利用qRT-PCR技术对固氮条件下三株重组菌株中的人工RNA模块的表达量进行分析，结果显示：与非固氮条件相比，在固氮条件下三株重组菌株中AneR的转录水平显著提高了1.5倍以上(图2)。(2)重组固氮工程菌株固氮酶活性测定利用乙炔还原法比较固氮条件下底盘菌株与重组菌株的固氮酶活性，结果显示：与底盘菌株相比，三株重组菌株固氮酶活性显著提高了20％左右(图3)。4、人工RNA模块AneR与固氮酶编码基因nifHDKmRNA结合能力分析利用微量热泳动(MicroscaleThermophoresis,MST)技术分析AneR与nifHDKmRNA之间的结合情况，结果显示：RNA模块AneR分别与nifH/nifD/nifKmRNA之间的微量热泳动拟合曲线均为典型的“S”型曲线，说明RNA模块AneR与nifH/nifD/nifKmRNA之间均有很好的结合趋势(图4)。5、人工RNA功能模块AneR对固氮酶基因nifHDKmRNA的稳定性分析利用qRT-PCR技术分析固氮条件下A1501和P.stutzeri(pAneR)中nifHDKmRNA的半衰期，结果显示：重组菌中的nifHDKmRNA的半衰期明显变长，其中重组菌中的nifHDKmRNA的半衰期约为25min，而野生型中的约为20min(图5)。本专利技术的有益效果实验证实，在固氮条件下，本专利技术的人工RNA模块AneR能够显著提高多种重组工程菌株固氮酶活性，明显增强固氮微生物底盘的固氮能力。本专利技术的启动子序列可以用于不同细菌中固氮基因的有效表达，因此可应用于各种人工高效固氮体系的构建。附图说明图1：人工RNA模块AneR表达载体的构建。图中基因转录方向用箭头表示，其中a图表示人工RNA模块AneR表达载体的构建示意图，插入位点为BamHI和HindШ；图中b图表示表达载体pAneR的PCR验证。图2：qRT-PCR分析固氮条件下重组固氮工程菌株P.stutzeri(pAneR)、K.pneumoniae(pAneR)和A.vinelandii(pAneR)中人工RNA模块AneR的转录水平。图3：底盘菌株和重组工程菌株P.stutzeri(pAneR)、K.pneumoniae(pAneR)和A.vinelandii(pAneR)固氮酶活性测定。图4：人工RNA模块AneR与固氮酶编码基因nifH/nifD/nifKmRNA结合能力测定。图5：底盘微生物P.stutzeriA1501和重组菌株P.stutzeri(pAneR)中固氮酶基因nifHDKmRNA半衰期测定序列信息SEQIDNO:1人工RNAAneR模块的核苷酸序列。...

【技术保护点】
1.核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的人工RNA编码序列。/n

【技术特征摘要】
1.核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的人工RNA编码序列。


2.权利要求1所述的人工RNA与固氮酶基因nifHDKmRNA相互作用的用途。


3.权利要求1所述的人工RNA在构建人工固氮体系中的应用。


4.含权利要求1所述的人工RNA的质粒。


5...

【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，战嵛华，燕永亮，柯秀彬，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11