阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体涉及阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法。本发明专利技术要解决的技术问题是，改良水稻籽粒性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达，提高水稻籽粒性状的方法。本发明专利技术方法能得到籽粒千粒重、粒长或粒宽增加的水稻突变体，表明其籽粒性状得到了很大的改良，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。

【技术实现步骤摘要】
阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类非编码内源小分子RNA长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子(大多为21个核苷酸)。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中，经RNA聚合酶II转录为长约300-1000个碱基的初级miRNA(primarymiRNA，pri-miRNA)，接着加工为长约70-90个碱基含茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，然后再经过Dicer酶酶切，成为长约20-24个碱基的成熟miRNA。成熟的miRNA随后组装进RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，通过碱基互补配对的方式识别并集合靶基因mRNA，根据互补程度的不同指导RISC降解靶mRNA(完全互补)或者阻遏靶mRNA翻译(不完全互补)，从而参与真核生物的转录后基因表达调控。然而，随着越来越多的植物miRNA被鉴定和获得，绝大部分miRNA的生物学功能还不清楚。水稻OsmiR394基因位于基因组的第三号染色体上，其前体(stem-loop)DNA长110个核苷酸。有研究表明MicroRNA394(miR394)通过对其靶基因LEAFCURLINGRESPONSIVENESS(LCR)进行剪切，调控植物的盐胁迫及叶片夹角大小。但是目前对miR394的其它生物学功能还知之甚少。以前，研究miRNA功能主要通过靶基因类似物(TargetMimicry，TM)或短串联靶标类似物(ShortTandemTargetMimic，STTM)来干扰(封闭)miRNA，从而能反映目标基因去阻遏的影响。但该模式对很多miRNA的干扰效率较低，甚至完全无活性的情况。近来，也有用CRISPR-Cas9来创制miRNA突变体的报道，但利用CRISPR-Cas9创制的突变体的缺失/插入片段大多集中在1～2bp的范围内，往往不会导致miRNA功能的完全丧失。CRISPR-Cas12a(CRISPR-Cpf1)系统是近年来发现的新的基因编辑系统。其与CRISPR-Cas9不同，因其具备“T/A”富集区的PAM识别位点、向导RNA为结构简单的单一crRNA分子、产生粘性末端、删除片断比较大(大多为6～13bp)等特性，对于定向敲除miRNA有其特有的优势。目前尚无运用该技术敲除水稻miRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，改良水稻籽粒性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是一种改良水稻籽粒性状的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，提高水稻籽粒性状。其中，上述方法中所述的阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达通过敲除水稻OsMIR394基因或者干扰OsMIR394基因表达产物的作用进行。进一步的，上述方法中所述敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行。更进一步的，所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。其中，上述方法中使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsMIR394基因时，包括以下步骤：a、设计针对水稻OsMIR394基因的向导RNA；b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsMIR394基因定向编辑突变体种子，即得提高籽粒性状的水稻突变体。优选的，上述方法中所述的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b中的至少一种。其中，上述方法中步骤a中所述的针对水稻OsMIR394基因的向导RNA的核苷酸序列为SeqIDNo.1所示。其中，上述方法中所述的提高水稻籽粒性状为提高千粒重、粒长或粒宽中的至少一种。同时，本专利技术还提供了阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂在提高水稻籽粒性状中的用途。其中，上述用途中所述阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达的试剂包括敲除水稻OsmiR394基因的试剂。进一步的，所述的敲除水稻基因组中的OsmiR394基因的试剂包括针对OsmiR394基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑OsmiR394编码基因的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。其中，上述用途中所述用于CRISPR-Cas12a的crRNA的核苷酸序列为SeqIDNo.1所示。本专利技术还提供了一种针对水稻OsmiR394基因的crRNA，核苷酸序列为SeqIDNo.1所示。相应的，本专利技术还提供了装载有上述crRNA的载体。优选的，所述载体含有核苷酸序列为SEQIDNo.2所述的主要表达单元。优选的，上述表达载体的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术针对水稻OsMIR394基因设计并筛选得到一条特定的crRNA，并以之为基础构建了用于特定敲除水稻OsMIR394基因的CRISPR-Cas12a基因编辑载体。实验表明，使用本专利技术方法得到的植株能够有效敲除水稻OsMIR394基因，并得到种子变大及增加千粒重的突变体，这在水稻的基因组功能研究以及miRNAs的研究和应用方面具有很好的前景。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种改良水稻籽粒性状的方法，该方法通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达从而来提高水稻籽粒性状。本专利技术方法中，敲除水稻OsMIR394基因，或者影响OsMIR394基因表达产物的作用，是阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的两种主要方式。在本专利技术的实施例中，敲除水稻OsmiR394编码基因后得到了籽粒千粒重、粒长或粒宽增加的水稻突变体，表明其籽粒性状得到了很大的改良，而其他农艺性状没有明显改变。本专利技术方法步骤简明、易于操作，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。附图说明图1.OsmiR394结构及CRISPR-Cas12amiRNA突变载体示意图A、OsmiR394结构示意图，下划线为成熟miRNA。B、定向敲除OsmiR394载体构建示意图，加粗为PAM位点，斜体为crRNA。图2.Cas12a-OsmiR394部分T0突变体植株鉴定A、转基因阳性PCR检测结果。B、T0代部分植株PCR-SSCP鉴定突变体结果，粗体下划线为突变体。C、部分T0代突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.改良水稻籽粒性状的方法，其特征在于：阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，提高水稻籽粒性状。/n

【技术特征摘要】
1.改良水稻籽粒性状的方法，其特征在于：阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，提高水稻籽粒性状。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达通过敲除水稻OsMIR394基因或者干扰OsMIR394基因表达产物的作用进行；优选的，敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行；更优选的，所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsMIR394基因时，包括以下步骤：
a、设计针对水稻OsMIR394基因的向导RNA；
b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；
c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；
d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsMIR394基因定向编辑突变体种子，即得提高籽粒性状的水稻突变体；
优选的，所述的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b中的至少一种。


4.根据权利要求3所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建平，张勇，郑雪莲，祁彩燕，
申请(专利权)人：成都极谷基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51