本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体涉及编辑水稻基因组中OsGBSSⅠ启动子及内含子1以提高稻米品质的方法。本发明专利技术要解决的技术问题是改良水稻稻米的品质性状。解决该技术问题的技术方案是提供了一种改良水稻直链淀粉含量的方法。该方法是通过基于基因编辑系统定向编辑OsGBSSⅠ基因启动子及内含子1，以降低该基因的表达量，进而不同程度降低直链淀粉的含量，获得水稻品质优良的水稻基因编辑材料。该方法能得到具有极佳稻米品质的材料在内的多个优质稻米材料。本发明专利技术方法步骤简明、易于操作，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。具有很好的前景。具有很好的前景。
【技术实现步骤摘要】
No.6、Seq ID No.8、Seq ID No.10或Seq ID No.12中的至少一个所示。
[0026]同时，本专利技术也进一步提供了上述的向导RNA或其互补的核酸分子、或者上述的表达载体在编辑水稻基因组中OsGBSSⅠ基因的启动子以提高稻米品质中的用途。尤其得到水稻直链淀粉含量不同程度降低的基因编辑突变体，以提高稻米其品质中的用途。
[0027]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种改良水稻品质性状的方法，该方法基于基因编辑系统定向编辑OsGBSSⅠ基因启动子元件及内含子1，调控OsGBSSⅠ基因表达。从而可以改变直链淀粉的含量，实现对水稻直链淀粉含量的有效调控,改良水稻稻米的直链淀粉含量相关的品质性状。实验表明，本专利技术方法能够高效编辑水稻OsGBSSⅠ基因启动子元件及内含子1，编辑水稻OsGBSSⅠ基因启动子元件及内含子1后可得到不同直链淀粉含量的新材料，非常便于进行品质改良的相关研究和应用。同时，还获得了具有极佳稻米品质的材料pZJP081
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09
‑1‑
07(直链淀粉含量13.3％)、pZJP081
‑
06
‑2‑
01(14.0％)、pZJP081
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18
‑1‑
04(13.6％)、pZJP081
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13
‑2‑
08(13.5％)和pZJP081
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09
‑2‑
07(13.2％)在内的多个优质稻米材料。本专利技术方法步骤简明、易于操作，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。
附图说明
[0028]图1.运用CRISPR
‑
Cas12a多位点定向编辑系统敲除水稻OsGBSSⅠ基因启动子元件及内含子1。A、水稻OsGBSSⅠ基因启动子及内含子1定向编辑靶位点设计示意图。B、CRISPR
‑
Cas12a多位点定向敲除载体设计示意图(基于骨架载体pTX377)。
[0029]图2.CRISPR
‑
Cas12a多位点定向敲除突变体T0鉴定图，其中的浅色编号表示该单株发生了大片段删除。
[0030]图3.OsGBSSⅠ定向编辑突变体T2种子直链淀粉(AC)含量测定。方框标示为获得最优质材料的AC含量，OsGBSS
Ⅰ‑
1是敲除掉GBSS1编码区的对照材料。
[0031]图4.OsGBSSⅠ定向编辑突变体T2种子胶稠度(GC)长度测定(方框标示为获得最优质材料的GC值)，OsGBSS
Ⅰ‑
1是敲除掉GBSS1编码区的对照材料。
[0032]图5.部分定向编辑突变体T2代种子KI
‑
I2染色观察。方框标示为获得的优质材料的染色情况(Scale bars＝1cm)，图中的OsGBSS
Ⅰ‑
2是敲除掉GBSS1编码区的对照材料。
[0033]图6.部分定向编辑突变体T2代种子垩白度观察。方框标示为获得的优质材料的透明度(Scale bars＝1cm)，图中的OsGBSS
Ⅰ‑
2是敲除掉GBSS1编码区的对照材料。
具体实施方式
[0034]在本专利技术前期针对水稻品质改良相关的大量研究工作的基础上，确定调控OsGBSSⅠ基因的表达模式(转录水平和胚乳特异性)主要由它的启动子(顺式元件)决定。本专利技术进而考虑通过CRISPR
‑
Cas12a基因组编辑技术，对水稻OsGBSSⅠ基因启动子进行编辑，降低该基因的表达，不同程度降低直链淀粉的含量，获得品质优良的编辑材料和优先编辑位点。同时，还考虑同时也设计针对OsGBSSⅠ基因内含子1的编辑位点与之配合，以期获得完全不转录的材料。
[0035]首先本专利技术通过在水稻OsGBSSⅠ基因启动子各元件及内含子1进行分析的基础上，设计筛选得到12个向导RNA(crRNA)(如图1A所示)。构建得到了能表达上述的crRNA表达载
体。其中，上述表达载体的骨架载体可选择pTX377、pYPQ230(Tang X,Lowder LG,Zhang T,Malzahn A,Zheng X,Voytas DF,Zhong Z,Chen Y,Ren Q,Li Q,Kirkland ER,Zhang Y,Qi Y.2017.A CRISPR
‑
Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants.Nature Plants,3:17018；Tang X,Ren Q,Yang L,Bao Y,Zhong Z,He Y,Liu S,Qi C,Liu B,Wang Y,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2019.Single transcript unit CRISPR 2.0systems for robust Cas9 and Cas12a mediated plant genome editing.Plant Biotechnology Journal,17(7):1431
‑
1445)等植物Cas12a定向编辑表达载体。在本专利技术的实施例中使用pTX377作为骨架载体，取得了高效编辑效果。优选得到了定向敲除载体pZJP081(主要表达单元如图1B所示)。
[0036]专利技术人发现使用上述基因编辑体系能够高效得到水稻OsGBSSⅠ基因启动子不同编辑突变体。而且获得品质优良(直链淀粉含量介于10％～14％)的九个编辑材料：pZJP081
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09
‑1‑
07，pZJP081
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06
‑2‑
01，pZJP081
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‑1‑
04，pZJP081
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13
‑2‑
08，pZJP081
‑
09
‑2‑
07，pZJP080
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05
‑2‑
09，pZJP081
‑
12
‑3‑
10，pZJP081
‑
11
‑3‑
05，pZJP081
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05
‑3‑
03，pZJP081
‑
11
‑1‑
05。
[0037]因此，本专利技术提供了上述的crRNA或表达载体在创制OsGBSSⅠ基因启动子及内含子1突变体、提高稻米品质的应用。包括以下步骤：
[0038]a、设计并优选crRNA、构建OsGBSSⅠ基因启动子及内含子1的CRISPR
‑
Cas12基因编辑表达载体；
[0039]b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，获得遗传转化植株；
[004本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.编辑水稻基因组中OsGBSSⅠ基因的启动子及内含子1以提高稻米品质的方法，其特征在于包括以下步骤：a、构建可表达针对水稻OsGBSSⅠ基因的启动子和/或内含子1的向导RNA的Cas基因编辑表达载体；b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR
‑
Cas基因编辑体系得到转化植株；c、收集转化植株的种子，筛选出基因编辑突变体种子，得到直链淀粉含量改良的基因编辑水稻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的向导RNA为Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.8、Seq ID No.9、Seq ID No.10、Seq ID No.11或Seq ID No.12中的至少一种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的向导RNA为Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.6、Seq ID No.8、Seq ID No.10和Seq ID No.12。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：可表达该组向导RNA的Cas基因编辑表达载体为CRISPR
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Cas12a基因编辑表达载体；其包括玉米泛素启动子ZmUbi1启动的Cas12a表达单元和水稻泛素启动子OsUbi1启动的crRNA
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scaffold表达单元；启动子CaMV35S启动的潮霉素抗性基因Hyg表达单元；其crRNA
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scaffold表达单元串联表达Seq ID No.2、Seq ID No.4、Seq ID No.6、Seq ID No.8、Seq ID No.10或Seq ID No.12所示的向导RNA中的至少一种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的转化水稻使用的是农杆菌介导转化方法。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体的crRNA
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scaffold表达单元中包括Seq ID No.18所示的片段。7.表达载体，其特征在于：能表达编辑水稻基因组中OsGBSSⅠ基因的启动子和内含子1的一条或多条向导RNA。8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于：所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：周建平，祁彩燕，钟超，郑雪莲，张勇，唐旭，赵雨欣，
申请(专利权)人：成都极谷基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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