用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法技术方案

本发明专利技术实施例公开了一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法，所述基因编辑系统，包括Cas9、sgRNA和ssDNA，所述Cas9和sgRNA构成RNP复合物，所述sgRNA为外源基因的插入位点，所述ssDNA为外源基因的插入模板。本发明专利技术主要利用基因编辑技术，通过ssDNA利用作为外源基因的插入模板，在sgRNA的配合下，成功在AAVS1位点实现4.5kb(aAPC1：EF1a

【技术实现步骤摘要】
用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其是一种基因编辑系统和方法，具体涉及一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法。

技术介绍

[0002]稳定表达细胞株又称稳转细胞株是指通过分子生物学方法，使特定基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达或干扰基因表达，它是基因功能研究、模型建立、作物育种、药物开发及基因治疗等最常用的手段之一。
[0003]传统稳转细胞株的构建方法主要可分为非病毒和病毒两大类，非病毒稳转细胞株的构建主要通过电转或脂质体等转染质粒或转座子到细胞中，利用抗生素(如嘌呤霉素)半数致死浓度对细胞不断加压，从而使包含特定基因的质粒整合到染色体DNA，最终通过多轮细胞筛选从而获得稳转细胞株；病毒方法多为使用逆转录病毒和慢病毒等，按照一定的MOI对目的细胞进行转染，转染48h或72h后对细胞进行筛选，获得稳定表达的细胞株。
[0004]但上述两种方法获得的稳定表达细胞株均发生了目的基因在染色体DNA的随机整合，很容易引起其它基因功能的丧失，同时插入的拷贝数和位置不固定。因此，同一来源的细胞系中不同的细胞间表达差异比较明显，可能存在潜在的风险，干扰最终的实验结果，在免疫治疗中，这种随机整合也会带来潜在的致病、致癌风险。

技术实现思路

[0005]针对上述目的，本专利技术的目的是提供一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法，从而使改造后的细胞遗传背景更为简单和统一，排除插入位点和拷贝数对其它基因功能的影响。
[0006]本专利技术一方面提供一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统，包括Cas9、sgRNA和ssDNA，所述Cas9和sgRNA构成RNP复合物，所述sgRNA为外源基因的插入位点，所述ssDNA为外源基因的插入模板。
[0007]在本专利技术的优选实施例中，所述插入位点包括PD1、TIGIT、AAVS1、CTLA-4、Tim3和LAG3。
[0008]在本专利技术的优选实施例中，当所述插入位点为AAVS1时，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列；所述sgRNA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
[0009]在本专利技术的优选实施例中，在本专利技术的优选实施例中，所述外源基因为aAPC1，所述ssDNA包括aAPC1和设于其两侧的同源臂，所述aAPC1的结构为EF1a-CD19-CD86-CD64-PolyA，所述两侧的同源臂分别为LHA和RHA，所述LHA与EF1a相连，所述RHA与PolyA相连。
[0010]在本专利技术的具体实施方式中，所述aAPC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同
源序列；所述aAPC1的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或
[0011]所述LHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其同源序列；所述LHA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或
[0012]所述RHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或其同源序列；所述RHA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
[0013]本专利技术一方面还提供一种用于外源基因定点插入的方法，包括以下步骤：
[0014]1)根据要插入的外源基因，选择插入位点，再根据所述插入位点设计、合成sgRNA和ssDNA；
[0015]2)然后将Cas9和所述sgRNA形成RNP复合物，然后再将所述RNP复合物与所述ssDNA形成用于外源基因定点插入的基因编辑系统(RNP-ssDNA复合物)；
[0016]3)培养K562细胞，再将所述外源基因通过步骤2)中形成的用于外源基因定点插入的基因编辑系统插入所述K562细胞中，得到定点插入外源基因的K562细胞，即得。
[0017]在本专利技术的优选实施例中，在步骤1)中，所述插入位点包括PD1、TIGIT、AAVS1、CTLA-4、Tim3和LAG3。
[0018]在本专利技术的优选实施例中，当所述插入位点为AAVS1时，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列；所述sgRNA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
[0019]在本专利技术的优选实施例中，在步骤3)中，将所述外源基因通过电转或脂质体转染插入所述K562细胞中。
[0020]在本专利技术的优选实施例中，所述外源基因为aAPC1，所述ssDNA包括aAPC1和设于其两侧的同源臂，所述aAPC1的结构为EF1a-CD19-CD86-CD64-PolyA，所述两侧的同源臂分别为LHA和RHA，所述LHA与EF1a相连，所述RHA与PolyA相连。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述aAPC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列；所述aAPC1的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或
[0022]所述LHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其同源序列；所述LHA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或
[0023]所述RHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或其同源序列；所述RHA的同源序列与
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统，包括Cas9、sgRNA和ssDNA，所述Cas9和sgRNA构成RNP复合物，所述sgRNA为外源基因的插入位点，所述ssDNA为外源基因的插入模板。2.根据权利要求1所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述插入位点包括PD1、TIGIT、AAVS1、CTLA-4、Tim3和LAG3。3.根据权利要求2所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，当所述插入位点为AAVS1时，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其同源序列；所述sgRNA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。4.根据权利要求1所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述外源基因为aAPC1，所述ssDNA包括aAPC1和设于其两侧的同源臂，所述aAPC1的结构为EF1a-CD19-CD86-CD64-PolyA，所述两侧的同源臂分别为LHA和RHA，所述LHA与EF1a相连，所述RHA与PolyA相连。5.根据权利要求4所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述aAPC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其同源序列；所述aAPC1的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述LHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其同源序列；所述LHA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述RHA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或其同源序列；所述RHA的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。6.一种用于外源基因定点插入的方法，包括以下步骤：1)根据要插入的外源基因，选择插入位点，再根据所述插入位点设计、合成sgRNA和ssDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗凤鹏，曹青，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：