构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用技术

本发明专利技术公开了一种构建体，携带IL15super激动剂基因序列，构建体的组成包括依次连接的用于编码信号肽的核苷酸序列、IL15super激动剂基因序列、IgG FC核苷酸序列、胞外区核苷酸序列、跨膜区核苷酸序列、胞内区核苷酸序列。本发明专利技术方案所公开的构建体在生物学功能方面有效地提高了抗肿瘤功效，且具有靶点广谱性和特异性可以用于制备抗肿瘤细胞药物。异性可以用于制备抗肿瘤细胞药物。异性可以用于制备抗肿瘤细胞药物。

【技术实现步骤摘要】
构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用


[0001]本专利技术是关于生物技术，特别是关于一种构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、免疫治疗产品及应用。

技术介绍

[0002]免疫疗法为当下肿瘤治疗领域最受关注和最具前景的发展方向之一，随着免疫疗法的研究深入和应用范围逐渐扩大，尤其以CAR
‑
T细胞疗法为代表的新兴免疫细胞治疗技术在治疗血液肿瘤方面(急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤)取得显著疗效，甚至有些患者完全缓解，这是恶性肿瘤治疗领域中里程碑式的突破。据研究数据统计，在临床前研究和临床试验中CAR
‑
T 疗法表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。例如，CD19 CAR
‑
T细胞在CD19阳性恶性血液肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗的可行性。
[0003]虽然以CAR
‑
T为代表的免疫细胞治疗技术针对复发/难治性恶性血液肿瘤取得巨大成功，但CAR
‑
T疗法分离培养过程耗时较长、费用昂贵、患者采集的T细胞状态参差不齐降低了临床扩展性并增加了操作难度，导致该疗法目前仅有望在部分患者收益；除此之外，临床试验也发现CAR
‑
T疗法存在较为严重的细胞因子释放综合征CRS、神经毒性等严重毒副作用、复发率高、实体肿瘤疗效不佳等使其广泛应用面临重大挑战。
[0004]近年来，NK细胞免疫疗法也表现出巨大的发展潜力，嵌合抗原受体(CARs) 修饰后的NK细胞表现出增强的抗肿瘤活性，并且已有的动物体内实验及临床试验均表明，该疗法相较于CAR
‑
T疗法，尤其在实体肿瘤中，安全性和有效性方面都具有更大的优势。
[0005]NK92细胞系来源于非霍奇金淋巴瘤患者的外周血单核细胞，是一株白细胞介素(IL2)高度依赖性NK细胞，具有较好的细胞毒活性，并且作为一种肿瘤细胞能够在体外无限增殖和规模化制备，并表现出良好的临床安全性和有效性，也是目前FDA批准的唯一可用于临床实验的NK细胞系。但该细胞通过过继疗法输入机体后，由于人体内IL2浓度较低，不足以维持NK92细胞的生长，因此，该细胞在体内存活时间非常短暂，在一定程度上，可能限制了该疗法的临床效果；但又因为在高浓度IL2条件下，会发生严重的不良反应，并刺激免疫抑制Treg细胞的优先扩增，这限制了通过CAR
‑
NK联合IL2 方法在癌症治疗中的应用。
[0006]白细胞介素(IL
‑
15)在结构上与IL
‑
2具有同源性，他们共用受体(IL2/15 βγ)的β和γ链，但结合不同的α受体链(IL
‑
2Rα/IL
‑
15Rα)，IL15作为一个被广泛研究的抗肿瘤候选药物，与IL2具有许多共同的生物学活性，包括激活T细胞、B细胞和NK细胞，并促进这些细胞的增殖和存活。此外， IL15能激活、维持和扩增CD8+记忆性T细胞，而不参与调节性T细胞功能的维持。该细胞因子不仅能够刺激并维持IL2依赖的细胞系的增殖，又具有类似IL2的生物学功能，因而成为一种较为理想的细胞因子治疗候选药物。
[0007]但IL15作为细胞因子药物仍然存在较多不足，主要体现在以下几个方面： 1.IL15的抗肿瘤效果依赖于高浓度的IL15的持续产生或给予；2.IL15的半衰期较短，药效的维持需要持续反复给药，增加了给药难度和安全性风险；3. IL15单体生物活性较低，限制了其
进一步的应用；4.IL15的作用是全身性的，可能会致使免疫系统广泛性激活，并常常伴随较为致命的风险。所以需要一种增强型的IL15药物或其CAR
‑
NK联合体，使其靶向性作用于肿瘤部位的同时，又不影响正常组织，从而发挥出联合体用药的优势。
[0008]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用，其能够提供一种携带IL15 super激动剂基因序列的构建体，通过在 ROBO1 CAR
‑
NK细胞的基础上增加IL15 super激动剂基因，从而进一步增强 CAR
‑
NK细胞的生物学功能活性和安全性。
[0010]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了一种构建体，该构建体包括依次连接的用于编码信号肽的核苷酸序列、IL15 super激动剂基因序列、IgG FC 核苷酸序列、胞外区核苷酸序列、跨膜区核苷酸序列、胞内区核苷酸序列。
[0011]在本专利技术的一个或多个实施方式中，该构建体能够提供一种携带IL15super激动剂基因序列。其中，IL15 super激动剂基因序列包括IL15序列与 IL15Rα受体胞外域序列的不同组合体。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，构建体还包括Linker序列，所述 Linker核苷酸序列为如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：2所示，其中Linker序列排列于如下任一：IL15核苷酸序列和IL15R α受体胞外域序列之间、 IL15super激动剂基因序列和IgG FC核苷酸序列之间。进一步优选的，其中 Linker序列排列于如下任一：IL15 super激动剂基因序列和IgG FC序列之间、野生型的IL15核苷酸序列和IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列之间、或野生型的IL15序列和IL15Rα
‑
sushi序列之间、IL15 N72D和IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列之间、IL15 N72D和IL15Rα
‑
sushi序列之间。
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，用于编码信号肽的核苷酸序列可选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、 CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种，本专利技术中，用于编码信号肽的核苷酸序列为CD8信号肽核苷酸序列：所述CD8信号肽核苷酸序列选自如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列、满足以所述CD8信号肽核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，IgG FC核苷酸序列为如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、满足以所述IgG FC核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。通过在构建体中加入IgG FC序列与IL15super基因共同表达后能增加IL15 的生物活性并延长其半衰期。
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，胞外区核苷酸序列可选自：CD28、 CD3ε、CD45、CD4、CD5、C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建体，携带IL15 super激动剂基因序列，其特征在于，所述构建体的组成包括依次连接的用于编码信号肽的核苷酸序列、IL15 super激动剂基因序列、IgG FC核苷酸序列、胞外区核苷酸序列、跨膜区核苷酸序列、胞内区核苷酸序列。2.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体还包括Linker序列，所述Linker序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中Linker序列排列于如下任一：IL15核苷酸序列和IL15Rα受体胞外域序列之间、IL15super激动剂基因序列和IgG FC核苷酸序列之间。3.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述用于编码信号肽的核苷酸序列为CD8信号肽核苷酸序列：所述CD8信号肽核苷酸序列选自如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、满足以所述CD8信号肽核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述IgG FC核苷酸序列选自如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列、满足以所述IgG FC核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述胞外区核苷酸序列为CD8胞外区序列，所述CD8胞外区核苷酸序列选自如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、满足以所述CD8胞外区核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。6.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述跨膜区核苷酸序列为CD8跨膜区序列，所述CD8跨膜区核苷酸序列选自如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列、满足以所述CD8跨膜区核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。7.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述胞内区核苷酸序列为CD8胞内区核苷酸序列，所述CD8胞内区核苷酸序列选自如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列、满足以所述CD8胞内区核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。8.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述IL15 super激动剂基因序列包括IL15核苷酸序列与IL15Rα受体胞外域核苷酸序列的组合中的一种或多种。9.如权利要求8所述的构建体，其特征在于，所述的IL15核苷酸序列包括如下任一：1)野生型的IL15核苷酸序列，所述野生型的IL15核苷酸序列选自SEQ ID NO：8、满足以所述野生型的IL15核苷酸序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：22至少约98％同一性；2)编码野生型IL15的第72位氨基酸Asn突变成Asp，命名为N72D核苷酸序列，所述N72D核苷酸序列选自SEQ ID NO：9、满足以所述N72D核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少约98％同一性。10.如权利要求8所述的构建体，其特征在于，所述的IL15Rα受体胞外域核苷酸序列包括如下任一：1)IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列，所述IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列选自如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列、满足以所述IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列；
2)IL15Rα
‑
sushi结构域核苷酸序列，所述IL15Rα
‑
sushi结构域核苷酸序列选自如SEQ ID NO：11所示的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦治明，韩昆昆，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：