细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用。本发明专利技术公开了细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR

【技术实现步骤摘要】
细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用


[0001]本专利技术是关于生物、免疫技术，特别是关于一种细胞、NK细胞的免疫治疗产品、基因敲除方法、细胞制备方法及应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是危害人类健康的最重要疾病之一。肿瘤的发病率目前一直呈持续增长趋势，现已成为严重的社会负担。到目前为止，肿瘤治疗的发展已经经历了从手术切除、放射性疗法、化疗、靶向药物疗法，直至细胞免疫治疗的突破性发展。
[0003]近年来，基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T
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cell immunotherapy, CAR
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T)备受关注。作为一种“活”药，CAR
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T疗法与传统药物疗法有着很大的区别。该疗法通过基因转导使患者的T细胞表达嵌合抗原受体，使其既能够维持特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备自我增殖和杀伤能力，达到治疗肿瘤的目的。2010年，CD19CAR
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T成功治疗了一例淋巴瘤患者。此后，CAR
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T细胞疗法开始普遍应用于包括急性和慢性淋巴瘤细胞白血病等难治性B细胞恶行肿瘤的临床治疗，并且取得了显著的临床治疗效果。这为工程化T细胞带来了良好的应用前景。截止到2021年5月，共有5款CAR
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T细胞药物获批上市。但随着研究的深入和应用的不断增多，CAR
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T细胞药物产生的不良反应逐渐被认识和关注，例如CAR
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T细胞治疗的毒副作用（细胞因子风暴和神经毒性）、实体肿瘤对其的耐受性与抗性、肿瘤免疫抑制微环境、工艺的复杂性、细胞生产的周期与成本等等已经成为制约CAR
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T细胞疗法的瓶颈。积极寻找可以解决目前CAR
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T细胞药物缺陷的其它免疫疗法，克服目前CAR
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T细胞对实体瘤疗效不佳的挑战显得尤为重要。
[0004]然而，肿瘤细胞在长期的进化过程中也形成了一套自身的免疫逃逸机制，其中PD
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1/PD
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L1免疫检查点路径已经成为肿瘤治疗的研究热点。PD
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1 (Programmed cell death 1, 也称PDCD1)在20世纪90年代初期就已经被发现报道，而其配体PD
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L1(Programmed cell death 1 ligand 1, 也称PDCD1LG1)在1999年被相继发现。肿瘤细胞在受到免疫细胞进攻以及免疫细胞释放的γ干扰素的影响下，会诱导其表面PD
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L1的表达，PD
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L1蛋白是PD
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1的配体，两者结合后便会向免疫细胞传递抑制信号，导致免疫细胞进入静息状态，使其无法识别肿瘤细胞，同时使免疫细胞自身增殖减少甚至凋亡，有效解除机体的免疫反应。目前，基于PD
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1/PD
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L1免疫检查点介导的免疫逃逸机制，各大国际制药巨头纷纷致力于PD
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1抑制剂和抗体药物的临床研究和开发。自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞是机体固有的免疫系统组成部分，在机体抗肿瘤免疫监视过程中发挥着重要作用，其也是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞。与T细胞一样，NK细胞也可进行修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强识别肿瘤抗原和抗肿瘤活性。
[0005]自2013年以来，CRISPR/Cas9已成为目前最有效的基因编辑系统，其具有高效、简便、快速和特异性等特点，被广泛应用于动物、植物、微生物以及细胞等领域。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术的有效应用，肿瘤免疫治疗也产生了重大的突破。2021年1月，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）批准了针对输血依赖型β地中海贫血的CRISPR/Cas9基
因编辑疗法产品的临床试验申请，这是国内首个获国家药监局批准开展临床试验的基因编辑疗法产品和造血干细胞产品。这也为基因治疗产品再细胞免疫疗法的应用打开了新的篇章。
[0006]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种细胞、NK细胞的免疫治疗产品、基因敲除方法、细胞制备方法及应用，其能够通过基因编辑的手段，在特定位点敲除PD
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1，协同改善肿瘤免疫抑制微环境、进而激发机体产生内在的主动抗肿瘤激发免疫效应，从而实现持久缓解。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR
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NK细胞，RNP复合物包括Cas9蛋白和sgRNA，目标位点为PD
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1，sgRNA至少包括核苷酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
[0009]在本专利技术的一个或多个实施方式中， CAR
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NK细胞表达靶向ROBO1的嵌合抗原受体。
[0010]在本专利技术的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活CAR
‑
NK细胞。
[0011]在本专利技术的一个或多个实施方式中，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，抗原结合结构域为Fab或scFv。
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，跨膜结构域选自CD28、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4
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1BB和OX40中的一种或多种。
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体是结构为scFv
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CD8
‑4‑
1BB
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CD3ζ融合蛋白，scFv
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CD8
‑4‑
1BB
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CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本专利技术的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体是结构为scFv
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CD8
‑4‑
1BB
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR
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NK细胞，所述RNP复合物包括Cas9蛋白和sgRNA，其中在于，所述目标位点为PD
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1，所述sgRNA至少包括核苷酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述CAR
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NK细胞表达靶向ROBO1的嵌合抗原受体。3.如权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活所述CAR
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NK细胞。4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域为Fab或scFv。6.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选自CD28、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。7.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4
‑
1BB和OX40中的一种或多种。8.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体是结构为scFv
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CD8
‑4‑
1BB
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CD3ζ融合蛋白，所述scFv
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【专利技术属性】
技术研发人员：张骏，韩昆昆，李华顺，
申请(专利权)人：阿思科力苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：