一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种高效表达重组猫干扰素-ω2(rFeIFN-ω2)突变体的哺乳动物细胞悬浮培养工艺，该培养工艺在生物反应器中进行，包括：(1)培养初始温度设定为36.5℃，溶氧40％、pH7

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达重组猫干扰素
ω
2突变体的哺乳动物细胞培养工艺


[0001]本专利技术涉及一种高效表达rFeIFN-ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺，属于生物制药

[0002]专利技术背景
[0003]1985年，干扰素ω首次从仙台病毒诱导的Namalwa细胞中克隆得到，现已鉴定出在猫、猪、马、兔、蝙蝠、牛和羊中存在。1992年，猫干扰素基因被Nakamura分离得到，随后rFeiIFN-ω药物研制成功并成为唯一一个获批上市的猫干扰素ω制剂，该制剂称为Virbagen Omega，已在日本和欧美国家广泛使用。主要用于治疗猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒感染性疾病和犬细小病毒感染性疾病，同时对猫病毒性鼻气管炎、猫杯状病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、传染性肠胃炎病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒等感染型疾病的治疗也表现出良好的治疗效果。
[0004]近年来随着对猫科干扰素-ω的深入研究，我国学者刘文军等人于2005年从猫中分离获得13种新型猫干扰素-ω，其中，通过酵母表达体系获得的-ω2表现出最强的抗病毒活性(刘文军等：猫ω干扰素及其编码基因与应用。2005，授权公告号：CN 1730491A)(Yang et al:Cloning and Characterization of a Novel Feline IFN-ω.JOURNAL OF INTERFERON&CYTOKINE RESEARCH.2007；27:119
–
127)。2015年，胡小元等人通过比对猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，对猫ω2干扰素进行氨基酸定点突变，将编码猫ω2干扰素突变体的基因克隆到杆状病毒转移载体中与杆状病毒重组感染昆虫宿主，表达外源基因，获得猫ω2干扰素突变体蛋白，通过突变使猫ω2干扰素的抗病毒活性提高45％以上(胡小元等：猫ω2干扰素突变体及其制备方法和应用。2015，授权公告号：CN 108276486A)。若能将猫ω2干扰素突变体蛋白实现产业化生产，将会具有良好应用前景。目前FeINF-ω主要在大肠杆菌、酵母以及家蚕杆状病毒体系中成功表达，但大肠杆菌表达的rFeINF-ω活性不佳，家蚕杆状病毒表达体系所表达的产物其N-聚糖结构上存在高比例的核心α1,3岩藻糖，具有潜在的免疫原性反应(Minagawa S et al.Novel recombinant feline interferon carrying N-glycans with reduced allergy risk produced by a transgenic silkworm system.BMC Vet Res.2018；14:260)。
[0005]哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工修饰能力，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。猫属于哺乳动物，且rFeINF-ω是一种糖蛋白，由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白，不仅在活性方面高于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，同时可以克服因昆虫或植物细胞表达体系特有的N-聚糖链核心α1-3岩藻糖所带来的免疫原性风险。但哺乳动物细胞表达体系成本高、效率低。因此本专利技术开发出一种操作简单易控、成本低廉的工艺方法，经本专利技术工艺生产的rFeINF-ω2突变体蛋白，其产量可达2.5g/L以上，产物抗病毒活性明显优于其它表达体系。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种高效表达rFeINF-ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺，使其克服采用哺乳动物细胞表达低效、成本高昂的问题。具体地，为rFeINF-ω2突变体蛋白的产业化提供一种操作简单易控、成本低廉、表达产物产量高、的生产培养工艺，其主要技术方案如下：
[0007]将表达rFeINF-ω2突变体的哺乳动物细胞接种至含无血清基础培养基的生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中控制温度、溶氧、pH、转速，且培养过程中定期流加不同无血清补料培养基、水解物和谷氨酰胺，同时监测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液。
[0008]优选地，所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞，优选CHO DG44细胞。
[0009]优选地，所述的细胞接种密度为5-8
×
105/mL，优选5
×
105/mL。
[0010]优选地，所述的生物反应器基础培养基的工作体积为1-500L，转速设置为10-200转/分钟，具体地，
[0011]7升生物反应器中培养基的工作体积为1-5L，优选3L工作体积；设置转速100-200转/分钟，优选150转/分钟；
[0012]50升生物反应器中培养基的工作体积为10-40L，优选30L工作体积；设置转速80-120转/分钟，优选90转/分钟；
[0013]250升生物反应器中培养基的工作体积为40-200L，优选150L工作体积；设置转速10-80转/分钟，优选50转/分钟；
[0014]优选地，所述的温度控制是初始培养温度设置为36℃-38℃，优选36.5℃；培养第6天开始降低培养温度至33℃。
[0015]优选地，所述的溶氧控制条件为30％-80％，优选40％；
[0016]优选地，所述的pH控制范围为5-7.5，优选7
±
0.3；
[0017]优选地，所述的无血清培补料培养基1流加方式为第3、6、8、10、12天分别流加5％、5％、5％、5％、3％的无血清补料培养基；所述的无血清补料培养基2流加方式为第4、7、9、11天分别流加2％的无血清补料培养基；
[0018]优选地，所述的水解物流加方式为第5、8天分别流加6g/L的水解物；
[0019]优选地，所述的无血清基础培养基由浓度为10-30g/L的ActiPro培养基、浓度为10-20g/L的SFM4CHO培养基中的一种或几种组成；另含添加物，由浓度为0.5-2g/L的F68、3-5g/L的葡萄糖、4-8mM谷氨酰胺中的一种或几种组成，pH7-7.5。
[0020]优选地，所述的无血清补料培养基1，由浓度为100～200g/L的Cell Boost 7a、50～100g/L的Cell Boost 7b补料中的一种或几种组成；无血清补料培养基2，由浓度为50～100g/L的EX-CELL Advanced CHO Feed 1补料组成。
[0021]优选地，所述的水解物，由浓度为50～200g/L的Hypep 7504、50～200g/L的PF Plus ACF水解物中的一种或几种组成；
[0022]本专利技术的有益效果：提供了一种简单、高效表达rFeINF-ω突变体的哺乳动物细胞培养工艺，使其表达产物产量高、成本低、抗病毒活性佳、适合大规模产业化应用。
附图说明
[0023]图1显示了rFeINF-ω突变体蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达重组猫干扰素-ω2(rFeIFN-ω2)突变体的哺乳动物细胞培养工艺，其特征在于，所述培养工艺包含具体步骤如下：(1)将常规制备的种子细胞接种至含无血清基础培养基的生物反应器中进行悬浮培养；(2)细胞接种密度为5-8
×
105cells/mL，优选5
×
105cells/mL；(3)生物反应器中基础培养基的工作体积为1-500L，转速设置为10-200转/分钟，具体地，7升生物反应器中培养基的工作体积为1-5L，优选3L工作体积；设置转速100-200转/分钟，优选150转/分钟；50升生物反应器中培养基的工作体积为10-40L，优选30L工作体积；设置转速80-120转/分钟，优选90转/分钟；250升生物反应器中培养基的工作体积为40-200L，优选150L工作体积；设置转速10-80转/分钟，优选50转/分钟；(4)初始培养细胞设置温度为36℃～38℃，优选36.5℃；(5)设置溶氧条件为30％～80％，优选40％；(6)控制pH值在5～7.5范围，优选7
±
0.3；(7)于培养第3天补充3-10％的无血清补料培养基1，优选5％，同时补加1～5mM的谷氨酰胺，优选2mM；培养过程中补充葡萄糖溶液使培养液中葡萄糖含量不低于2g/L，培养过程控制细胞活率在70％以上；(8)于培养第4天补充1％～5％的无血清补料培养基2，优选2％；(9)于培养第5天补充1～10g/L的水解物，优选6g/L；(10)于培养第6天再次补充5％的无血清补料培养基1，并将温度调节至33℃继续培养；(11)于培养第7天再次补充2％的无血清补料培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：代燕平，王雯茜，高小平，罗弟祥，
申请(专利权)人：成都彤琦恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：