本发明专利技术提供了酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用。本发明专利技术涉及将免疫调节肽或抗菌肽与鸭干扰素α(DuIFNα)串联并与酵母细胞壁GPI结构域融合，使DuIFNα与免疫调节肽或抗菌肽被展示到酵母细胞表面，形成GPI锚定的DuIFNα串联免疫调节肽或抗菌肽的融合蛋白。与现有技术相比，酵母细胞培养过程简单、培养时间短、原料成本低廉，是实现大规模生产DuIFNα融合蛋白的首选。本发明专利技术的GPI锚定DuIFNα融合蛋白可作为药物和饲料添加剂，口服用于预防和治疗水禽类动物病毒和细菌感染性疾病。和治疗水禽类动物病毒和细菌感染性疾病。
【技术实现步骤摘要】
酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白及其应用
[0001]说明书
[0002]本专利技术涉及酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白，尤其涉及串联了乳铁蛋白水解肽、胸腺肽以及天蚕素的鸭干扰素α与毕赤酵母细胞壁GPI结构域的融合，以及该融合蛋白在用于预防和治疗水禽类动物感染性疾病，尤其鸭或鹅相关病毒或合并细菌感染性疾病中的应用。
技术介绍
[0003]干扰素具有抗病毒和免疫调节的作用，其中，干扰素α(IFNα)和干扰素β(IFNβ)主要参与抗病毒、抗肿瘤过程。干扰素γ(IFNγ)则可诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应。干扰素的抗病毒和免疫调节作用促进了重组干扰素的发展，如重组鸭干扰素α作为注射液，在预防和治疗鸭、鹅病毒感染性疾病方面已显示良好的效果。但是，注射用重组鸭干扰素在应用上受到极大地限制，尤其在超大型鸭场，采用人工注射是一项非常耗时的工作。而且，单独鸭干扰素对治疗混合细菌感染如大肠杆菌、鸭里默氏杆菌与病毒混合感染性的水禽类疾病仍然十分有限。
[0004]天蚕素是一类主要从家蚕或家蝇中分离得到的抗菌肽，是最具潜力的抗生素替代品之一，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有很强的抑制作用，我们的研究发现，天蚕素能显著抑制大肠杆菌和鸭里默氏杆菌的生长，推测其与干扰素α联合使用能有效防治细菌、病毒混合感染性鸭疾病。乳铁蛋白水解肽B与胸腺肽α1既有免疫调节作用，也兼具抗菌和抗病毒作用，若与鸭干扰素融合，在抗细菌、病毒混合感染性鸭疾病方面不失为一类理想的联合治疗方案。
[0005]酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术之后发展的新的细胞表面展示系统，因具有和哺乳动物细胞相似的蛋白质合成和翻译后修饰功能，以及蛋白质的分泌功能，在外源蛋白的表达方面具有超越大肠杆菌的显著优势。酵母细胞表面提供了展示功能蛋白质的空间，外源蛋白可以通过与细胞壁锚定结构域融合而共价锚定到酵母细胞壁上。中国专利(林影等，2011)已公开系列酵母细胞壁蛋白，应用细胞壁蛋白成功地将碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B等外源蛋白展示在酵母表面(Zhang L等,2013；Li C等，2014；Wang P等，2016；Guo D等，2016)。此外，某些酵母如酿酒酵母和毕赤酵母的非致病性和天然佐剂特性，其表面展示外源蛋白已成为开发公共卫生和农畜牧养殖等疫苗的理想模式，应用其开发口服或食用疫苗取得了显著的成效。但迄今为止，在酵母细胞表面展示鸭干扰素以及鸭干扰素与其它小肽类分子的融合蛋白尚未见文献报道。
[0006]本专利技术采用酵母细胞作为宿主，将串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素与酵母细胞壁GPI结构融合，并通过GPI锚定结构域将鸭干扰素融合蛋白展示在酵母细胞表面。
技术实现思路
[0007]本专利技术包括串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素α与酵母细胞壁GPI结构域的融合，DuIFNα与免疫调节肽或抗菌肽之间包含接头肽(Linker)，其组成为：A+Linker+B，其中，A为DuIFNα，B为免疫调节肽或抗菌肽，接头肽为(GGGGS)n；本专利技术还包括在A+Linker+B序列的N端或C端通过接头肽与细胞壁GPI结构域的融合，形成如下组成结构：
[0008]GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Lfcin B
[0009]DuIFNα+Linker+Lfcin B+Linker+GPI
[0010]GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Tα1
[0011]DuIFNα+Linker+Tα1+Linker+GPI
[0012]GPI+Linker+DuIFNα+Linker+Cecropins
[0013]DuIFNα+Linker+Cecropins+Linker+GPI
[0014]细胞壁GPI结构域选自毕赤酵母，包括Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p和Gcw61p等系列蛋白结构域。
[0015]优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Lfcin B，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0016]优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Tα1，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 3所示；其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
[0017]优选地，Gcw61p通过接头肽被插入到A+接头肽+B序列的N端或C端，其中，A为DuIFNα，B为Cecropin B，接头肽为(GGGGS)n，如SEQ ID NO 5所示；其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。
[0018]本专利技术还提供了预防和治疗水禽类病毒或合并细菌感染性疾病的方法，包括口服给鸭或鹅有效量的上述融合蛋白的方法。
[0019]本专利技术的有益效果包括：
[0020](1)鸭干扰素
‑
α与免疫调节肽或抗菌肽的融合蛋白可有效对抗多种病毒和致病微生物合并感染；
[0021](2)GPI表面展示的DuIFNα融合蛋白可与饮水或饲料混合，以口服形式给予鸭或鹅等水禽类动物；
[0022](3)GPI表面展示的DuIFNα融合蛋白可避免繁琐的下游过程，如分离和纯化等步骤。
附图说明
[0023]图1显示了pPICZα/DuIFNα
‑
Lfcin B
‑
GPI表达质粒酶切产物电泳结果
[0024]图2显示了DuIFNα
‑
Lfcin B
‑
GPI融合蛋白与His抗体的免疫印迹结果
[0025]图3显示了酵母表面展示的DuIFNα
‑
Lfcin B诱导OAS基因的表达
具体实施方式
[0026]下面以DuIFNα+Lfcin B+GPI融合蛋白为例，进一步阐述本专利技术，这些实施例仅用
于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。
[0027]实施例1本专利技术的融合蛋白克隆构建
[0028]DuIFNα与Lfcin B的融合蛋白编码基因分别选自GenBank:AB302328.1和L19981.1，两者之间以Linker连接，再将融合蛋白末端通过Linker与Gcw61p蛋白相连，在其5
′
端和3
′
端分别引入内切酶位点XhoI和NotI，通过人工合成DuIFN
‑
Lfcin B
‑
GPI融合蛋白编码基因，并将其插入到pPICZα载体，构建了酵母展示的重组表达质粒pPICZα/DuIFNα
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Lfcin B
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GPI。pPICZα/DuIFNα
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Lfcin B
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GPI表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.酵母表面展示的鸭干扰素融合蛋白，其包含串联了免疫调节肽或抗菌肽的鸭干扰素α(DuIFNα)与酵母细胞壁GPI结构域的融合，形成GPI锚定的DuIFNα/免疫调节肽或抗菌肽融合蛋白。2.如权利要求1的融合蛋白，其中所述的免疫调节肽或抗菌肽为乳铁蛋白水解肽(Lfcin B)；胸腺肽α1(Tα1)和天蚕素(Cecropins)。3.如权利要求1的融合蛋白，其中所述酵母细胞壁GPI结构域选自毕赤酵母，包括Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p和Gcw61p等。4.如权利要求1的融合蛋白，其中免疫调节肽或抗菌肽与DuIFNα串联融合，以及与细胞壁GPI结构域的融合是通过连接肽(...
【专利技术属性】
技术研发人员：高小平，付伟，李晟，代燕平，
申请(专利权)人：成都彤琦恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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