一种猪干扰素-α8突变体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪干扰素-α8(PoIFN-α8)突变体及其制备方法。该突变体具有(1)在第18位上将丙氨酸由脯氨酸取代和第21位上将丝氨酸由缬氨酸取代；(2)在101位点上将Asp置换为Asn，形成N-连接型糖蛋白的Asn-X-Ser糖基化修饰；(2)本发明专利技术还涉及PoIFN-α8突变体的应用，注射给药后，可显著增加PoIFN-α8突变体的血药浓度-时间曲线下面积。时间曲线下面积。

【技术实现步骤摘要】
一种猪干扰素-α
8突变体及其制备方法
[0001]说明书


[0002]本专利技术涉及生物兽医药
，具体涉及一种PoIFN-α8突变体及其制备方法。
[0003]专利技术背景
[0004]干扰素(interferon，IFN)与其受体结合，诱导细胞产生具有酶活性的抗病毒蛋白，进而发挥抗病毒和免疫调节等作用。IFN诱导的抗病毒活性存在种属差异性和亚型差异性，猪干扰素(pocrine interferon,PoIFN)主要分为I型、II型和III型，I型包括IFN-α、β、δ、ω和τ，IFN-γ为II型，而IFN-λ属于III型，猪干扰素I型抗病毒活性最强，其中IFN-α的抗病毒作用最广、效果最显著。重组PoIFN-α1具有良好的生物活性，已被广泛用于抗病毒制剂，另有报道PoIFN-α8也具有高抗病毒活性，且抗水泡性口炎等部分病毒作用明显强于IFN-α1，因此PoIFN-α8也具有极为重要的临床应用价值。
[0005]重组制备的IFN-α及分离获得的天然IFN-α均具有半衰期短、清除快的局限，且重组IFN-α(recombinant IFN-α,rIFN-α)的抗病毒活性仍不理想。中国专利(CN104818283B)公开了一种优化的PoIFN-α8基因及其表达方法，虽然使PoIFN-α8在原核中以可溶性表达，但原核表达的PoIFN-α8不能进行糖基化修饰。无糖基化修饰干扰素因其半衰期短，需要长时间的频繁给药，因此其临床应用受到限制。因此，提高干扰素的半衰期是治疗领域的发展方向。目前，能延长半衰期的干扰素主要为PEG化形式，例如和已在临床用于乙型肝炎和丙型肝炎的治疗。此外，在干扰素分子中引入或置换N-糖基化修饰位点也是延长重组干扰素血浆半衰期的有效手段。如对人干扰素-a(huIFN-a)引入4-5个N-糖基化修饰(Ceaglio,N等；2008)，通过皮下注射并与非N-糖基化修饰的huIFN-a比较，可使血浆半衰期明显延长。
[0006]为了延长PoIFN-α8的血浆半衰期，本专利技术针对PoIFN-α8分子的Asp-X-Ser序列，将Asp(第101位)置换为Asn，形成N-连接型的Asn-X-Ser糖基化修饰。此外，本专利专利技术人应用CHO细胞表达体系发现，携带自身信号肽的PoIFN-α8能在CHO细胞中成功表达和分泌，但因自身信号肽的酶切割特异性差，使PoIFN-α8的表达产量不能达到产业化要求。因此，进一步将PoIFN-α8的信号肽实施突变，使PoIFN-α8在CHO细胞中实现高效表达和分泌。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种PoIFN-α8突变体，所述的PoIFN-α8突变体是在第18位的丙氨酸(Ala)由脯氨酸(Pro)替换、第21位的丝氨酸(Ser)由缬氨酸(Val)替换和第101位的天冬氨酸(Asp)由天冬酰胺(Asn)替换，和在羧基末端增加6
×
组氨酸(His)。
[0008]本专利技术提供了一种PoIFN-α8突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]为获得本专利技术提供的一种PoIFN-α8突变体，本专利技术提供了一种PoIFN-α8突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)人工合成PoIFN-α8突变体核苷酸序列，在其两端分别引入内切酶位点Avr II
和Pac I，并在ATG之前引入GCCACC序列，末端添加6
×
His序列，如SEQ ID NO:2所示。将人工合成的PoIFN-α8突变体核苷酸序列与改造优化的UCOE表达载体(pUCOE-M)连接，转化大肠杆菌，经表达、筛选和双酶切鉴定，构建pUCOE-M/rPoIFN-α8m表达质粒。
[0011](2)将pUCOE-M/rPoIFN-α8m表达质粒线性化并分别电转至CHO细胞，优选CHO DG44细胞，采用无血清培养48h后，加入氨甲喋呤(MTX)至终浓度10nM，随后逐步增加至100-500nM；
[0012](3)将MTX增加至500nM的细胞以相同密度接种至摇瓶，用商业化培养基连续培养并适当补加葡萄糖等营养添加物。于连续培养第12天收集上清，ELISA定量检测上清中的干扰素分泌量。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]提供了一种PoIFN-α8突变体及其制备方法，与现有技术相比，一方面，本专利技术将101位点Asp置换为Asn，形成了Asn-X-Ser序列，使本专利技术在哺乳动物细胞中实现了糖基化修饰，延长了PoIFN-α8在血浆中的半衰期。另一方面，本专利技术将第18位Ala由Pro取代和第21位Ser由Val取代，第21位信号肽切割特异性消失，第23位信号肽切割的特异性提高，实现了PoIFN-α8突变体在哺乳动物细胞高效表达和分泌。
附图说明
[0015]附图用于进一步理解和解释本专利技术，但不构成对本专利技术的限制。
[0016]图1显示了rPoIFN-α8m质粒目的基因酶切产物鉴定
[0017]图2显示了rPoIFN-α8m蛋白表达水平
[0018]图3显示了纯化的rPoIFN-α8M的分子量
具体实施方式
[0019]实施例1 rPoIFN-α8突变体表达质粒构建和鉴定
[0020]从GenBank获得PoIFN-α8序列(登录号：GQ415062.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。将编码第18位丙氨酸的密码子突变为CCG，编码第21位丝氨酸的密码子突变为GTG，编码第101位天冬氨酸的密码子突变为AAT，并进行密码子偏好优化。在其5
′
端和3
′
端分别引入内切酶位点Avr II和Pac I，并在Avr II酶切位点之后、ATG之前引入GCCACC序列，末端添加6
×
His序列；人工合成PoIFN-α8突变体(PoIFN-α8M)基因，将其与改造优化的UCOE表达载体(pUCOE-M)连接，转化Top10感受态细胞，获得rPoIFN-α8M表达质粒；用Avr II和Pac I限制性内切酶对表达质粒进行双酶切，质粒酶切产物经1％琼脂糖凝胶鉴定(图1)显示，rPoIFN-α8M表达质粒构建成功，同时构建rPoIFN-α8表达质粒。
[0021]实施例2质粒转染和蛋白表达
[0022]采用Axygen Plasmid Max Kit试剂盒提取rPoIFN-α8M和rPoIFN-α8表达质粒，经Pvu I内切酶线性化后，参照Amaxa Cell Line NucleofectorTM Kit V试剂盒说明方法，分别将线性化的rPoIFN-α8m和rPoIFN-α8质粒稳定转染至CHO DG44细胞。转染后的细胞经无血清培养48h后，各加入含10nM MTX的选择培养基继续培养，随后逐步增加MTX浓度从100nM至500nM。
[0023]将MTX增加至500nM的细胞以相同密度接种至摇瓶，用商业化培养基Acti Pro连续
培养12天(细胞密度均为5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪干扰素-α8突变体(PoIFN-α8)，其特征在于，所述PoIFN-α8突变体是在其第18位的丙氨酸(Ala)由脯氨酸(Pro)替换、第21位的丝氨酸(Ser)由缬氨酸(Val)替换、第101位的天冬氨酸(Asp)由天冬酰胺(Asn)替换，和在羧基末端增加6
×
组氨酸(His),其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。2.编码如权利要求1所述PoIFN-α8突变体的核苷酸序列，如SEQ ID NO2所示。3.如权利要求1所述的PoIFN-α8突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)人工合成如SEQ ID NO2所示的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：付伟，高小平，代燕平，李晟，罗弟祥，
申请(专利权)人：成都彤琦恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：