适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和微生物代谢工程领域，公开了适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用，本发明专利技术人工设计了四种适用于地衣芽胞杆菌的启动子（R1‑R4）。接着，以绿色荧光蛋白GFP、角蛋白酶KER为目的蛋白，与启动子P43相比，研究发现启动子R2效果最佳，显著提高了GFP、KER的表达水平，其中GFP产量提高63.5倍，KER酶活提高7.8倍。最后，将启动子R2应用于代谢工程中，与对照菌株相比，通过将其应用于代谢途径强化使聚γ‑谷氨酸、杆菌肽的产量分别提高了52.09％和20.39％。

【技术实现步骤摘要】
适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用
本专利技术涉及基因工程和微生物代谢工程领域，具体涉及适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用。
技术介绍
启动子是位于基因转录单元上游的一段特殊DNA序列，具有启动基因转录的功能，并在调控基因转录水平中发挥着重要的作用。随着合成生物学和代谢途径工程的发展，人们逐渐发现，为了实现目标产物的高产，强化目的蛋白的表达水平和目的代谢物的代谢通量是至关重要的。由于启动子是基因转录的开关，并被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，从而启动子改造是开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。目前，启动子改造策略主要围绕着σ因子识别和结合的启动子核心区(-35区、核心间隔区、-10区)做改良工作。如周等人在枯草芽胞杆菌中，通过随机突变策略改造启动子PsrfA的核心间隔区，获得的最佳突变启动子PBH4较原始启动子PsrfA，使GFP的表达水平提高了2倍(DOI:10.1186/s12934-019-1148-3)，又如严等人在枯草芽胞杆菌中，通过对启动子PylB的-35区和-10区进行突变，获得的最佳突变启动子PNBP3510较原始启动子PylB，使β-半乳糖苷酶(BgaB)活性提高近25倍(DOI:10.1186/s12934-019-1159-0)，以及王等人对T7启动子核心区(-35区和-10区)进行组合，得到的最佳启动子P21285提高了L-天冬酰胺酶和酸性脲酶在大肠杆菌中的产量(DOI:10.1002/biot.201800298)。地衣芽胞杆菌是一个重要的工业生产模式菌株，具有分泌蛋白能力强特征，且被美国FDA认定为生物安全性菌株，从而其可作为蛋白和目标代谢物生产的优良宿主。目前，其已经实现多种蛋白和代谢物高效生产，如α-淀粉酶、碱性蛋白酶，杆菌肽等。然而，地衣芽胞杆菌在表达多数外源蛋白时，存在表达难或表达效率低的问题，而启动子被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，且启动子改造是开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。在地衣芽胞杆菌中，启动子主要包括σA型和σB型启动子，其中σA型启动子主要介导与细胞生长和代谢相关基因的表达，而σB型启动子主要介导细胞响应内外各种压力(温度、渗透压、pH等)相关基因的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子序列为SEQIDNO.2-SEQIDNO.5中的任意一个。适用于地衣芽胞杆菌的启动子在高效表达目的蛋白中的应用，将本专利技术的启动子导入地衣芽胞杆菌中，可提高地衣芽胞杆菌生产目的蛋白的能力。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示；或SEQIDNO.3所示；或SEQIDNO.4所示；或SEQIDNO.5所示。适用于地衣芽胞杆菌的启动子在提高地衣芽胞杆菌目的蛋白表达量中的应用，将本专利技术提供的启动子，导入地衣芽胞杆菌中，可提高蛋白表达和代谢产物的产量；将所述的启动子启动外源蛋白的表达可提高蛋白表达量，将所述的启动子启动增强代谢产物产量的基因表达，可提高代谢产物的产量。以上所述的应用中，优选的，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白和角蛋白酶；以上所述的应用中，优选的，所述代谢产物为γ-PGA和杆菌肽；以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2和地衣芽胞杆菌WX-02。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术人首次尝试通过核心区四组合镶嵌模式改造启动子的常规核心区(-35区(6bp)、-10区(6bp)、核心间隔区(16-18bp))，使其核心区完全由σ因子识别的四个位点组成(A-35-B-35-C-35-D-35-A-10-B-10-C-10-D-10，A、B、C和D序列长度为5-6bp),进而，在不同σ因子识别作用下，改善该启动子在发酵对数期和稳定期的活性，从而使其介导表达的基因在整个发酵周期都能有效表达。2.本专利技术人首次表明启动子核心区四组合镶嵌模式“σB-σB-σA-σB”可作为启动子优化的有效策略，且该核心区四组合镶嵌模式的序列长度为43-46bp，导致其构建非常方便，以非常低廉的费用直接通过引物设计导入表达载体中。3.本专利技术人先获得一组基于启动子核心区四组合的启动子(R1-R4)。接着，与启动子P43相比，研究发现启动子R2效果最佳，显著提高了GFP、KER的产量。最后，将启动子R2应用于代谢工程中，与对照菌相比，通过将其应用于代谢途径强化使聚γ-谷氨酸，杆菌肽的产率分别提高了52.09％，20.39％，从而说明改造得到的启动子R2不仅性能良好，而且具有一定的普适性。附图说明图1为R1-R4启动子对GFP表达的影响示意图。图2为R2启动子对角蛋白酶表达的影响示意图。图3为R2启动子对WX-02产γ-PGA的影响示意图。图4为R2启动子对DW2产杆菌肽的影响示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本专利技术以2种外源蛋白(绿色荧光蛋白GFP、角蛋白酶)和两种代谢产物(γ-PGA、杆菌肽)为例，说明本专利技术技术方案的优越性。实施例1：适用于地衣芽胞杆菌的启动子的获得：本专利技术的启动子，是通过在σA和σB型因子识别的五个结合位点中，在保证启动子核心区完全由σA和σB型因子识别位点组成的前提下，有选择的选取四个位点嵌合而成，所述的五个结合位点的核苷酸序列分别为：TTGACA…TATAAT；GCCTTGA…CCCCAT；TTCTCA…TAAAAT；AAGCCA…TATATT；GTAAAA…TATTAT；根据上述5个结合位点，选取了四种嵌合方式后，人工设计并合成了四个优化启动子，命名为R1-R4，其对应的核苷酸序列分别为SEQIDNO.2-SEQIDNO.5所示。实施例2:优化启动子R1-R4在提高地衣芽胞杆菌外源蛋白表达量中的应用：在本实施例中，通过引物直接引入了R1-R4启动子，替换了表达载体中的P43启动子核心区，具体步骤如下：1、以本实验早期构建的质粒pHY-P43-GFP(DOI:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)作为模板，通过表1的引物，PCR扩增出包含优化启动子的载体骨架，并进行DNA回收；表1：含有不同优化启动子的表达载体引物设计注：划线为同源臂区，18-19bp。2、利用DpnI酶对残留的pHY-P43-GFP模板进行消化；3、采用Vazyme的同源重组酶(ExnaseII)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌中；最后通过测序验证后，提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。


2.适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。


3.适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。


4.适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。


5.权利要求1-4中的所述的任一启动子，在提高地衣芽胞杆菌外源蛋白表达量中的应用。


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【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，饶忆，蔡冬波，马昕，莫非，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42