一种基于基因修饰得到人重组干扰素的融合基因、融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于基因修饰得到的人重组干扰素融合基因、融合蛋白及其制备方法，属于生物制品技术领域。基于基因修饰得到人重组干扰素IFN‑β的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由基因编码的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术对人重组干扰素IFN‑β基因序列进行扩增，与质粒pET‑28a(+)相连接得到融合基因，再将融合基因转染至大肠杆菌BL21(DE3)中进行扩增和表达得到了可溶性的融合蛋白，解决了大肠杆菌中无法获得可溶性干扰素的问题。本发明专利技术还提供了从稳定细胞系获得高纯度的IFN‑KE50蛋白的纯化方法，由于其具有组氨酸标签，用固定金属镍进行亲和层析可以对目标蛋白进行有效的纯化，纯化后蛋白纯度可达到94.8％。简化了后续的纯化步骤，并可以获得更高的纯度。

A fusion gene, fusion protein and preparation method of recombinant interferon based on gene modification

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因修饰得到人重组干扰素的融合基因、融合蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种基于基因修饰得到的人重组干扰素的融合基因、融合蛋白及其制备方法。技术背景干扰素是由诱导剂刺激网状内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等产生的一种具有多种功能的糖蛋白，具有属特异性。它们具有广谱的抗病毒活性及免疫调节功能。根据干扰素的基因类型、结构特点和功能作用以及在细胞表面的受体类型，干扰素目前分为三种类型。Ⅰ型干扰素包括IFN-α，IFN-β，IFN-δ，IFN-ε，IFN-ω，IFN-κ，IFN-ζ和IFN-τ。其中，IFN-α又有20多种亚型；IFN-β只有一种亚型；Ⅱ型干扰素是IFN-γ；Ⅲ型干扰素为IFN-λ，又可分为IFN-λ1，IFN-λ2和IFN-λ3。干扰素可以结合特定的细胞表面受体并随后激活胞质信号转导通路，进而诱导一系列基因的表达，从而发挥其生物学作用。天然IFN-β是含有166个氨基酸的糖基化产物，IFNβ-1b是天然IFN-β第十七位半胱氨酸突变为丝氨酸的变5异体，是大肠杆菌表达系统的非糖基化产物。作为首个FDA批准的专门治疗复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的药物，干扰素β可以减缓RRMS病人的病情恶化，改善病人的身体状况。大肠杆菌是目前应用最广泛、最成功的表达体系，常作为高效表达的首选体系。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，具有遗传背景清晰，技术操作容易，培养条件简单，大规模培养简单经济的优点。虽然大肠杆菌系统可以用于目的蛋白的大量表达，但由于外源基因其中进行高效表达时，会形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒(即包涵体)。包涵体的形成的原因复杂，主要与胞质内蛋白质生成速率有关，由于新生成的多肽浓度较高，没有充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质聚集体。目的蛋白表达为包涵体后通常不具有生物学活性，并且其复性与纯化均非常困难。目前通过大肠杆菌体系表达干扰素均为包涵体表达，这严重影响了其生产效率及生产成本。
技术实现思路
基于此，本专利技术通过修饰基因序列引入带不同电荷的甘氨酸与赖氨酸，达到类似于两性离子聚合物的结构，以期实现IFN-β的可溶性表达。组氨酸标签是最为常用的亲和标签之一，通常由4-8个组氨酸构成，它的优点是表达方便且其较短的结构对蛋白质活性影响较低。组氨酸标签能够通过螯合作用特异性与表面固定的金属离子(Ni2+,Cu2+,Co2+等)结合。因此，本专利技术在结构中增加了一个6聚的组氨酸标签以方便后期蛋白纯化。本专利技术目的在于针对在原核表达系统中干扰素蛋白无法实现可溶性表达的问题，选取IFN-β型干扰素为例，通过在IFN-β序列中加入EK氨基酸重复单元使人IFN-β基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现可溶性表达并通过镍柱亲和层析一步实现高纯度纯化。本专利技术提供了一种基于基因修饰得到的人重组干扰素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)分别以干扰素基因和氨基酸序列为模板，分别进行PCR扩增，得到片段1和片段2；(2)将片段1和片段2通过PCR进行基因融合，得到融合基因；(3)分别酶切融合基因和表达质粒，再用DNA连接酶连接；(4)转化至大肠杆菌中扩增培养，IPTG诱导表达后，得到粗融合蛋白；(5)用镍柱亲和层析纯化步骤(4)所得粗融合蛋白，得到融合蛋白。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)所述干扰素基因包括IFN-α，IFN-β，IFN-δ，IFN-ε，IFN-ω，IFN-κ，IFN-ζ或IFN-τ。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)所述氨基酸序列由带有相反电荷的两种氨基酸的重复单元组成，所述重复单元包括赖氨酸(K)与谷氨酸(E)组成的重复单元。进一步地，上述技术方案中，步骤(2)所述融合基因由干扰素基因与在干扰素基因C端或N端添加包含10到100个带有相反电荷的两种氨基酸的重复单元组成的氨基酸序列组成。进一步地，上述技术方案中，步骤(3)所述表达质粒为pET系列质粒，所述pET系列质粒包括pET-28a(+)质粒。进一步地，上述技术方案中，步骤(4)所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。本专利技术还提供了一种基于基因修饰得到人重组干扰素IFN-β的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.2。进一步地，氨基酸序列为SEQIDNO.2的融合蛋白的制备方法，具体步骤为：(1)分别以干扰素IFN-β基因序列和氨基酸序列为模板，分别进行PCR扩增，得到片段1和片段2；所述氨基酸序列由带有相反电荷的两种氨基酸的重复单元组成，所述重复单元为赖氨酸(K)与谷氨酸(E)；(2)将片段1和片段2通过PCR进行基因融合，得到融合基因；(3)分别酶切融合基因和表达质粒，再用DNA连接酶连接；(4)转化至大肠杆菌中扩增培养，IPTG诱导表达后，得到粗融合蛋白；(5)用镍柱亲和层析纯化步骤(4)所得粗融合蛋白，得到融合蛋白。进一步地，上述技术方案中，步骤(2)所述融合基因由干扰素基因与在干扰素基因C端或N端添加包含10到100个氨基酸基序列组成。优选的，所述融合基因由干扰素基因与在干扰素基因C端或N端添加包含50个氨基酸基序列组成。进一步地，上述技术方案中，步骤(3)所述表达质粒为pET系列质粒，所述pET系列质粒包括pET-28a(+)质粒。本专利技术还提供了一种编码上述融合蛋白的人重组干扰素融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种含有所述融合蛋白的重组表达菌。进一步地，上述技术方案中，所述重组表达菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。所述感受态细胞(competentcell)是用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。大肠杆菌对数生长期为OD值在0.6-0.8之间，对数期的群体细胞具有生理特性比较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是代谢、生理研究的良好材料，不仅是作为菌种的最佳材料，更会提高诱导表达效率。有益效果：本专利技术的有益效果在于：本专利技术解决了利用原核表达体系表达IFN-β蛋白时不能获得可溶性、具备天然活性的IFN-β蛋白的难题，通过设计IFN-β基因的序列成功在IFN-β蛋白C端或N端引入聚EK肽链，并成功得到可溶性的IFN-KE50融合蛋白，所得IFN-KE50融合蛋白纯度可达到94.8％，此类方法也可在其他类型干扰素在原核菌中可溶性表达制备方面的应用。本专利技术对人重组干扰素IFN-β基因序列进行扩增，与质粒pET-28a(+)相连接得到融合基因，再将融合基因转染至大肠杆菌BL21(DE3)中进行扩增和表达得到了可溶性的融合蛋白，解决了大肠杆菌中无法获得可溶性干扰素的问题。本专利技术还提供了从稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于基因修饰得到的人重组干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)分别以干扰素基因和氨基酸序列为模板，分别进行PCR扩增，得到片段1和片段2；/n(2)将片段1和片段2通过PCR进行基因融合，得到融合基因；/n(3)分别酶切融合基因和表达质粒，再用DNA连接酶连接；/n(4)转化至大肠杆菌中扩增培养，IPTG诱导表达后，得到粗融合蛋白；/n(5)用镍柱亲和层析纯化步骤(4)所得粗融合蛋白，得到融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于基因修饰得到的人重组干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别以干扰素基因和氨基酸序列为模板，分别进行PCR扩增，得到片段1和片段2；
(2)将片段1和片段2通过PCR进行基因融合，得到融合基因；
(3)分别酶切融合基因和表达质粒，再用DNA连接酶连接；
(4)转化至大肠杆菌中扩增培养，IPTG诱导表达后，得到粗融合蛋白；
(5)用镍柱亲和层析纯化步骤(4)所得粗融合蛋白，得到融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述干扰素基因包括IFN-α，IFN-β，IFN-δ，IFN-ε，IFN-ω，IFN-κ，IFN-ζ或IFN-τ。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基酸序列由带有相反电荷的两种氨基酸的重复单元组成，所述重复单元包括赖氨酸与谷氨酸组成的重复单元。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：何炜，孙彬玉，程昉，李明洋，董继程，刘波，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21