OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途技术

本申请涉及生物技术领域，本申请提供一种OprJ‑N‑M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途，该OprJ‑N‑M融合基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。通过动物实验验证，由该OprJ‑N‑M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。

Oprj-n-m fusion gene and its fusion protein, preparation method and application of fusion protein

【技术实现步骤摘要】
OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途
本申请涉及生物
，特别是涉及一种OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白、融合蛋白制备方法以及用途。
技术介绍
绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa),又称铜绿假单胞菌，是一种普遍存在于环境中的革兰氏阴性菌。该菌为条件致病菌，是导致医院内复杂及持续感染的三大病原体之一。在正常人体内，绿脓杆菌可以与宿主维持共生关系互不侵扰，当宿主免疫力低下时，这种共生状态发生倾斜，绿脓杆菌大规模增殖，引发一系列的感染。比如，代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或烧烫的病人易感染本菌。绿脓杆菌感染的病灶可以导致血液散播，严重者可引起全身性败血症、脑膜炎或多器官衰竭，一旦发生败血症，其死亡率44％-81％，多器官衰竭达70％，整体死亡率高达50％。由于绿脓杆菌天然耐药性及广谱抗生素的滥用，多重耐药绿脓杆菌感染频繁发生，尤其耐碳青霉烯类绿脓杆菌(CRPsA)在全球的快速播散及感染情况日益严重，已严重危害公共健康。
技术实现思路
本申请提供一种OprJ-N-M融合基因及其融合蛋白的制备方法和用途。通过动物实验验证，由该OprJ-N-M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQIDNO:1所示。为解决上述技术问题，本申请采用的另一个技术方案是：提供一种OprJNM融合蛋白，所述OprJNM融合蛋白是通过如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因表达而获得的，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。其中，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括：绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c；其中，柔性连接体的氨基酸序列为AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。其中，所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ是通过OprJ基因表达而获得的，所述OprJ基因的碱基序列如SEQIDNO:2所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN是通过OprN基因表达而获得的，所述OprN基因的碱基序列如SEQIDNO:3所示；所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM是通过OprM基因表达而获得的，所述OprM基因的碱基序列如SEQIDNO:4所示。为解决上述技术问题，本申请采用的又一个技术方案是：提供一种OprJNM融合蛋白的制备方法，包括：提供一OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-N-M融合基因为如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因；将所述OprJ-N-M融合基因与载体pET28a通过NcoI和XhoI双酶切后，通过T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-OprJ-N-M；在预设培养条件下，培养所述重组质粒pET28a-OprJ-N-M转化至大肠杆菌BL-21菌株中，进行培养；分离纯化，得到所述OprJ-N-M融合基因所表达的所述OprJNM融合蛋白。为解决上述技术问题，本申请采用的再一个技术方案是：提供一种根据前述的OprJNM融合蛋白在制备治疗或预防绿脓杆菌感染的药物中的用途。为解决上述技术问题，本申请采用的再一个技术方案是：提供一种免疫原性组合物，包括：绿脓杆菌抗原组合和/或绿脓杆菌结合抗原；以及医药上可接受的载剂。其中，所述绿脓杆菌抗原组合包括：OprJ抗原、OprN抗原、OprM抗原中的至少两种；所述OprJ抗原含有如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；所述OprN抗原含有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；所述OprM抗原含有如SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。其中，所述绿脓杆菌结合抗原是包含特定氨基酸序列或由特定氨基酸序列组成的杂合多肽；其中，所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:5所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有至少50％同一性；和/或所述杂合多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:8所示的氨基酸序列具有至少50％同一性。其中，所述载剂选自：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝中的至少一种。本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提出一种OprJ-N-M融合基因，通过动物实验验证，由该OprJ-N-M融合基因表达的OprJNM融合蛋白可以有效的刺激机体产生高水平的体液及细胞免疫应答和良好的抗绿脓杆菌的感染的免疫保护作用。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：图1是本申请OprJNM融合蛋白设计示意图；图2是本申请三种绿脓杆菌外排泵蛋白OprJ、OprN和OprM的结构示意图；图3是SDS-PAGE分析纯化后的OprJNM融合蛋白的实验结果；图4是OprJNM融合蛋白在小鼠体内诱导强烈的体液免疫的实验结果；图5是OprJNM融合蛋白在小鼠体内诱导强烈IFN-γ，IL-4和IL-17A反应的实验结果；图6a和图6b是OprJNM融合蛋白在血液感染模型中诱导针对绿脓杆菌的保护作用的实验结果；图7是血清移植保护作用的实验结果。具体实施方式下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。在详细说明本申请之前，先介绍一下与本申请相关的基本概念。绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，简称P.aeruginosa),又称铜绿假单胞菌，是一种普遍存在于环境中的革兰氏阴性菌。该菌为条件致病菌，是导致医院内复杂及持续感染的三大病原体之一。在正常人体内，绿脓杆菌可以与宿主维持共生关系互不侵扰，当宿主免疫力低下时，这种共生状态发生倾斜，绿脓杆菌大规模增殖，引发一系列的感染。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种OprJ-N-M融合基因，其特征在于，所述OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQ IDNO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种OprJ-N-M融合基因，其特征在于，所述OprJ-N-M融合基因的碱基序列如SEQIDNO:1所示。


2.一种OprJNM融合蛋白，其特征在于，所述OprJNM融合蛋白是通过如权利要求1所述的OprJ-N-M融合基因表达而获得的，所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。


3.根据权利要求2所述的OprJNM融合蛋白，其特征在于，
所述OprJNM融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括：绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的结构域a、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的结构域b、柔性连接体、绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的结构域c；
其中，柔性连接体的氨基酸序列为AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK。


4.根据权利要求3所述的OprJNM融合蛋白，其特征在于，
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。


5.根据权利要求4所述的OprJNM融合蛋白，其特征在于，
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexCD-OprJ是通过OprJ基因表达而获得的，所述OprJ基因的碱基序列如SEQIDNO:2所示；
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexEF-OprN是通过OprN基因表达而获得的，所述OprN基因的碱基序列如SEQIDNO:3所示；
所述绿脓杆菌外排泵蛋白MexAB-OprM是通过OprM基因表达而获得的，所述OprM基因的碱基序列如SEQIDNO:4所示。


6.一种OprJNM融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
提供一OprJ-N-M融合基因，所述OprJ-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建东，张宝中，李文君，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44