一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，具体的标记方法如下：(1)构建pET‑22b‑SNAP‑Annexin V基因融合质粒载体；(2)通过原核表达并纯化pET‑22b‑SNAP‑Annexin V融合蛋白；(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化。Annexin V蛋白是目前发现的最佳PS结合受体之一，表现为对PS结合的高选择性和高结合力，荧光标记的Annexin V是目前检测早期细胞凋亡的最常用试剂之一。本发明专利技术创造了Annexin V荧光标记的新方法，首先通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与Annexin V蛋白融合、表达并纯化，随后用连接SNAP蛋白专一底物BG基团的小分子荧光探针标记融合蛋白进而标记Annexin V，通过细胞成像或者流式细胞仪检测凋亡细胞。本发明专利技术对细胞凋亡过程研究具有重要的意义。

A method of annexin V fluorescent labeling for early apoptosis detection

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测细胞早期凋亡的AnnexinV荧光标记的方法
本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于检测细胞早期凋亡的AnnexinV荧光标记的方法。
技术介绍
细胞凋亡是生物体维护内环境稳定而发生的程序性死亡。细胞凋亡异常会导致肿瘤、神经退行性和自身免疫性等多种疾病的发生。基于原位、实时和灵敏度高的特点，荧光检测细胞凋亡能够示踪凋亡过程，帮助解析凋亡异常相关疾病发生机理、筛选新药和建立有效的治疗方法。正常细胞中磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞质膜的内侧，而在细胞凋亡早期，PS从细胞质膜的内侧翻转到细胞质膜的外侧，是细胞凋亡开始的重要信号。因此，PS被用作检测细胞凋亡可靠标志物，通过识别细胞外膜的PS就可以检测凋亡细胞。AnnexinV蛋白是目前发现的最佳PS结合受体之一，表现为对PS结合的高选择性和高结合力，而荧光标记的AnnexinV就成为目前检测早期细胞凋亡的最常用试剂之一。AnnexinV主要通过共价连接小分子有机荧光染料或融合荧光蛋白的方式实现荧光标记。其中有机荧光染料通过与AnnexinV蛋白上的侧链氨基发生偶联反应实现标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测细胞早期凋亡的Annexin V荧光标记的方法，其特征在于具体的标记方法如下：/n(1)构建pET-22b-SNAP-Annexin V基因融合质粒载体；/n(2)通过原核表达并纯化pET-22b-SNAP-Annexin V融合蛋白；/n(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测细胞早期凋亡的AnnexinV荧光标记的方法，其特征在于具体的标记方法如下：
(1)构建pET-22b-SNAP-AnnexinV基因融合质粒载体；
(2)通过原核表达并纯化pET-22b-SNAP-AnnexinV融合蛋白；
(3)用荧光小分子标记融合蛋白并纯化。


2.根据权利要求1所述用于检测细胞早期凋亡的AnnexinV荧光标记的方法，其特征在于pET-22b-SNAP-AnnexinV融合基因质粒载体构建方法如下：
(1)引物设计：设计AnnexinV目的片段的上下游引物并引入Nhe1酶切位点，在酶切位点上游引入保护碱基，引物如下：
上游引物5’TACTAGCTAGCATGGCACAGGTTCTCAGAGG3’；
下游引物5’ACTAGCTAGCGTCATCTTCTCCACAGAGCAG3’；
(2)PCR扩增AnnexinV目的基因
PCR反应体系30-50μL：PCRbuffer(10×)3-5μL；dNTP(10×)3-5μL；pCMV-AnnexinV0.5-2μL；上下游引物(20nM)各0.5-1μL；pfuDNA聚合酶0.3-0.5μL；补灭菌双蒸水至总体积为30-50μL；
PCR反应条件如下：95℃30sec；[95℃30sec；55-58℃1min；68-72℃1-5min；]16-25个循环；68-72℃3min；4℃保温；
PCR结束后用PCR纯化试剂盒纯化目的片段，然后用NheI酶切使酶切位点暴露，跑0.8％的琼脂糖核酸电泳并切胶回收得到AnnexinV目的基因片段；
(3)酶切pET-22b-SNAPf质粒载体
酶切体系30-50μL：BufferM(10×)3-5μL；pET-22b-SNAPf质粒5-15μL；NheI1.5-3μL；补灭菌双蒸水至总体积30-50μL；37℃下酶切过夜。随后跑0.8％的琼脂糖核酸电泳，切胶回收大片段；
(4)连接AnnexinV和pET-22b-SNAPf片段得到融合质粒载体
连接体系10-20μL：上述切胶回收的AnnexinV与pET-22b-SNAPf摩尔比为6-10:1；连接buffer(10×)1-2μL；T4连接酶0.5-1μL；补灭菌双蒸水至总体积10-20μL；4℃连接4-8小时后取5-10μL连接产物转至E.coliDH5感受态中，挑取单斑测序确定连接结果，得到pE...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21