基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的融合蛋白及其作为化学治疗载体的用途制造技术

融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒及其用途。描述了基于人铁蛋白重链的融合蛋白，所述融合蛋白在蛋白质的N末端包含至少一个金属蛋白酶切割序列和经修饰的PAS多肽，所述经修饰的PAS多肽充当提高蛋白质药物稳定性的掩蔽聚合物，以及由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒，编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。

Fusion protein based on human ferritin and protease cleavable peptide and its application as chemotherapy carrier

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的融合蛋白及其作为化学治疗载体的用途
本专利技术涉及融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒、编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。本专利技术涉及融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒及其用途。描述了一种基于人铁蛋白重链的融合蛋白，所述融合蛋白在蛋白质的N末端包含至少一个金属蛋白酶切割序列和经修饰的PAS多肽，所述经修饰的PAS多肽充当提高蛋白质药物稳定性的掩蔽聚合物，以及由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒、编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。
技术介绍
在疾病区域选择性释放治疗剂是改善当前疗法特别是在抗癌疗法中最重要的挑战之一。在这种情况下，使用纳米颗粒作为治疗剂的载体(纳米载体)潜在地允许绕过可能存在于施用位点和最终靶标之间的生物屏障，并且更特别地，以选择性方式在疾病区域而不是正常组织中积累药物。作为基本前提，纳米载体必须能够以有效方式结合大量药物。在用于靶向药物释放的已知载体中，基于铁蛋白(Ft)的纳米颗粒由于其优异的生物相容性特征、穿过生物屏障的能力、功能化的多功能性以及结合某些类型药物的能力而变得越来越引人注意。Ft是由24个亚基组成的高度对称的多聚体蛋白质结构，这些亚基组装成具有基本球形外壳的分子结构，该外壳封闭了在生理上用于存储铁的腔。外径和内径分别为12和8nm。这样的壳状分子结构在下文中将被称为“纳米颗粒”或“HFt纳米颗粒”。与其它药物释放系统相比，基于人铁蛋白重链(HFt)的纳米颗粒显示出许多优势，尤其是在体内人体应用方面。实际上，HFt分子被设计为穿过生物屏障(最小直径20nm)，并且在生理条件下既存在于细胞内也存在于血液中，尽管浓度较低(约20μg/L)。作为天然成分，其不太可能引起强烈的非自身(外部)抗体和/或T细胞免疫反应。此外，HFt是少数能够自身以有效和选择性的方式结合肿瘤细胞的天然纳米颗粒之一。实际上，通过使用用于靶向癌症治疗的最具吸引力的分子之一转铁蛋白受体1(TfR1)，已证明HFt被内化。TfR1确实在许多类型的癌症表面上调(是正常细胞的多至100倍高)，并被有效地内化。在超过474个临床组织样品中已证明，HFt而非人铁蛋白的轻链(LFt)被TfR1内化并且与非肿瘤组织相比以98％的灵敏度和95％的特异性特异性地识别多种类型的肿瘤(即肝、肺、胰腺、结肠、宫颈、卵巢、前列腺、乳腺、肉瘤和胸腺癌)(FanK,CaoC,PanY,LuD,YangD,FengJ等人Magnetoferritinnanoparticlesfortargetingandvisualizingtumourtissues.NatNanotechnol.2012；7:459-64)。但是，天然HFt具有一些缺点。首先，其能够结合某些类型的药物例如多柔比星(具有广泛抗肿瘤谱的抗肿瘤药之一)的产率很低，并且这可能限制其可能的用途和临床开发。其次，当通过全身途径注射时，天然HFt的血浆半衰期非常短，约2-3小时。最后，其天然的亚铁氧化酶活性可能会抑制人成骨细胞的发育和成熟，并导致矿化降低、骨质减少和骨质疏松症(ZarjouA,JeneyV,ArosioP,PoliM,ZavaczkiE,BallaG,BallaJ.Ferritinferroxidaseactivity:apotentinhibitorofosteogenesis.JBoneMinerRes.2010,25:164-72)。因此，建议使用通过位点特异性突变获得的缺少亚铁氧化酶活性的没有抑制作用的HFt变体(以下称为vHFt)。最近，为了提高天然HFt的体内半衰期和HFt-药物复合物的稳定性二者，在WO2016051340A1中公开了一种适用于药物递送的新的基于HFt的构建体，名为HFt-MP-PAS。在该构建体中，每个HFt亚基的N末端与以下进行基因融合：i)PAS多肽序列，即富含脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)残基的序列；和ii)插入到每个HFt亚基和外部PAS多肽之间的对肿瘤蛋白酶(MMP)的蛋白水解切割有响应的肿瘤选择性序列(MP)。PAS屏蔽物旨在在药物封装过程(优选对于药物多柔比星)中增加蛋白质的稳定性，并增加蛋白质-药物复合物的稳定性。PAS的存在还能够掩盖蛋白质表面，从而延长其血浆半衰期。MP序列允许通过肿瘤微环境中存在的刺激(即，对该序列特异性的MMP)选择性地去除PAS屏蔽物，从而使得所得的未掩蔽的HFt可以与癌细胞中过表达的TfR1自由地相互作用并被其内化。HFt-MP-PAS构建物被证明：i)与野生型HFt相比，将三倍多的多柔比星(DOX)封装在内腔中，ii)形成更稳定的复合物(即药物渗漏可忽略不计)，并且iii)具有更高的体内循环时间。重要的是，负载DOX的HFt-MP-PAS(HFt-MP-PAS-DOX)在体内人胰腺癌模型中显示出优异的治疗功效，显著提高了整体动物存活率。这归因于PAS屏蔽，HFt的DOX封装、蛋白质-药物复合物稳定性和血浆中循环时间增加。然而，仍然需要提供改进的纳米颗粒作为治疗剂的载体(纳米载体)。
技术实现思路
专利技术人惊奇地发现，在PAS结构域中插入的至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基极大地改善了融合蛋白HFt-MP-PAS的性质，如从本公开内容的实例和附图中报道的实验数据清楚地表明的。特别地，专利技术人出乎意料地发现，在PAS结构域中插入带负电荷的残基(例如谷氨酸)的新构建体(HF-MP-PASE)在用于封装药物的反应结束时回收的蛋白质的量方面优于天然HFt和HFt-MP-PAS蛋白二者。而且，与天然HFt和HFt-MP-PAS相比，新构建体HF-MP-PASE显示出药物在细胞核中更高的积累、更高的血清稳定性和更高的肿瘤积累。因此，本专利技术的第一个目的是一种融合蛋白，该融合蛋白包含至少三个结构域，其中：(a)第一结构域包含天然人铁蛋白重链的氨基酸序列，或者与天然人铁蛋白重链的氨基酸序列具有至少90％同一性的其变体；(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；并且(c)第三N末端结构域由具有至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由或由脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基组成。本专利技术还提供了包含本专利技术化合物以及用于治疗应用的特定用途的组合物。该目的和其它目的通过如所附权利要求1中限定的融合蛋白来完成。其它独立权利要求和从属权利要求涉及构成说明书组成部分的本专利技术其它方面和特定实施例。为了改善和促进铁蛋白腔内的药物结合，专利技术人决定从蛋白质表面去除半胱氨酸残基，并在蛋白质腔中引入额外的半胱氨酸残基。以这种方式，可以以非常有效的方式将每个包含巯基反应性基序的分子(例如药物、接头、荧光团等)结合至内腔(参见实例和附图)。因此，本专利技术的另一个目的是天然人铁蛋白重链的突变蛋白，其中所述突变蛋白在蛋白质表面上没有任何半胱氨酸残基，并且在蛋白质内腔中具有至少一个半胱氨酸。另外，为了改善和促进铁蛋白腔内正电药物的结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包含至少三个结构域，其中：/n(a)第一结构域包含天然人铁蛋白重链的氨基酸序列，或者与天然人铁蛋白重链的氨基酸序列具有至少90％同一性的其变体；/n(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；并且/n(c)第三N末端结构域由具有至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由或由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸和至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基组成(PASE)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171106 IT 1020170001161841.一种融合蛋白，包含至少三个结构域，其中：
(a)第一结构域包含天然人铁蛋白重链的氨基酸序列，或者与天然人铁蛋白重链的氨基酸序列具有至少90％同一性的其变体；
(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；并且
(c)第三N末端结构域由具有至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由或由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸和至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基组成(PASE)。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域(PASE)具有小于80个氨基酸残基的长度，优选包含20至80个氨基酸残基，更优选包含40至75个氨基酸残基。


3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含SEQIDNO:1的天然人铁蛋白重链的氨基酸序列，或者SEQIDNO:2的人铁蛋白的重链变体的氨基酸序列，或者在蛋白质表面没有任何半胱氨酸残基并且在蛋白质的内腔中具有至少一个半胱氨酸或天冬氨酸或谷氨酸，优选在内腔中具有两个、三个或四个半胱氨酸或天冬氨酸或谷氨酸的人铁蛋白重链变体的氨基酸序列。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二结构域包含选自由MMP2、MMP3、MMP7和MMP9组成的组的基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列，特别地其中所述基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列选自由SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8组成的组。


5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域(PASE)在PASE结构域的15至20个残基内包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥尔多·布拉卡，
申请(专利权)人：西纳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT