具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供通过使蛋白酶识别序列与针对标签肽的抗体的表位重叠，可用于蛋白酶识别序列本身的检测和纯化的标签肽，并且提供利用该标签肽和针对该标签肽的抗体的重组蛋白的纯化方法。作为这样的标签肽，优选蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列，例如可举出具有氨基酸序列(1)RX1X2LYX3QGKDG(X1、X2和X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)的标签肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有蛋白酶识别序列的标签肽及其应用，具体而言，涉及具有蛋白酶识别序列的标签肽、编码该标签肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的重组载体、针对该标签肽的抗体、以及使用该抗体的蛋白纯化方法。
技术介绍
生命科学领域中，在基础研究、应用研究及产品开发的所有领域中均广泛进行着利用基因重组技术的蛋白的生产。并且，为了检测和纯化利用大肠杆菌或动物细胞表达的重组蛋白，通常在目标蛋白的末端附加由数个残基的肽构成的标签。但是，认为该标签会对目标蛋白的生物活性、结晶结构等产生影响，因此最终必须将其切除。因此，需要预先在标签和目标蛋白之间插入特异性的蛋白酶识别序列。例如，在非专利文献1中记载了将组氨酸标签和MBP(麦芽糖结合蛋白)标签组合、并且进一步附加有烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，以下称为“TEV”)蛋白酶识别序列的复合标签。另外，在非专利文献2中记载了组合有蛋白A、钙调蛋白结合肽(CBP)和 TEV蛋白酶识别序列的复合标签。但是，上述文献中记载的TEV蛋白酶识别序列，均只不过是为了将附加的标签切去而使用的，并非作为用于TEV蛋白酶识别序列自身的检测和纯化的标签而使用。如果蛋白酶识别序列本身能够作为检测和纯化用的标签使用，则能够飞跃性地简化构建体的设计。现有技术文献非专利文献1 =David S. ffaugh, Making the most of affinity tags. TRENDS in Biotechnology Vol. 23No. 6 June 316-320(2005)非专利文献 2 =Oscar Puig, et al.，The Tandem Affinity Purification (TAP) Method :A General Procedure of Protein Complex Purification.METHODS 24, 218-229(2001)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能够用于蛋白酶识别序列本身的检测和纯化的标签肽，并且提供利用该标签肽和针对该标签肽的抗体的重组蛋白的纯化方法。此外，本专利技术的目的还在于提供由该标签肽和第二标签肽组合而成、能够同时结合两种抗体的标签肽。为了解决上述课题，本专利技术包含以下的专利技术。 一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠。 一种标签肽，具有蛋白酶识别序列，其特征在于，该蛋白酶识别序列与针对该标签肽的抗体的表位重叠，该蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列。如上述或所述的标签肽，其特征在于，具有以下的氨基酸序列⑴3(DRX1X2LY)C3QGKDG (序列号 1)(X1, X2和\、相同或不同，表示任意的氨基酸残基)。如上述所述的标签肽，其中，氨基酸序列(1)为以下的氨基酸序列O):(2) RENLYFQGKDG (序列号 2、。 一种标签肽，其特征在于，由上述 W]中任一项所述的标签肽和第二标签肽组合而成。如上述所述的标签肽，其特征在于，能够同时结合针对上述 中任一项所述的标签肽的抗体和针对第二标签肽的抗体。 一种多核苷酸，其特征在于，编码上述 W]中任一项所述的标签肽。 一种重组载体，其特征在于，含有上述所述的多核苷酸。针对上述 中任一项所述的标签肽的抗体。如上述所述的抗体，其为由大鼠-小鼠杂交瘤2H5(FERM BP-11245)产生的单克隆抗体。大鼠-小鼠杂交瘤 2H5 (FERM BP-11245)。 一种蛋白的纯化方法，其中，包括下述(i) (iii)的步骤⑴使上述或所述的抗体与含有上述 中任一项所述的标签肽和目标蛋白的融合蛋白的试样作用而形成融合蛋白与抗体的结合物的步骤；(ii)使洗脱物质与上述⑴的步骤中得到的结合物作用而使融合蛋白从抗体中游离的步骤；(iii)从上述(ii)的步骤中得到的融合蛋白上切除标签肽的步骤。 一种试剂盒，用于表达、纯化、检测或定量蛋白，其中，包含上述所述的重组载体或者上述或所述的抗体。专利技术效果根据本专利技术，能够提供具有蛋白酶识别序列的标签肽和针对该标签肽的抗体。通过利用该标签肽和针对该标签肽的抗体，能够以容易的操作高纯度地纯化融合有该标签肽的目标蛋白，并且能够容易地标签将切去。另外，根据本专利技术，提供由具有蛋白酶识别序列的标签肽和第二标签肽组合而成的标签肽。该标签肽能够同时结合针对该标签肽的两种抗体，因此即使在无法容易地获得针对目标蛋白的抗体的情况下，也能够利用夹心ELISA等，能够检测微量蛋白。因此，根据本专利技术，即使是不熟练者也能够容易地纯化或检测由克隆的基因所表达的不稳定且微量的重组蛋白。并且，能够高精度地比较多个试样中的目标蛋白的含量。附图说明图1(a)是表示标签肽、蛋白酶识别序列与目标蛋白的融合蛋白的示意图。图1(b)是表示具有本专利技术的蛋白酶识别序列的标签肽与目标蛋白的融合蛋白的示意图。图2(a)是表示利用了两种标签肽的夹心ELISA法的示意图。图2(b)是表示利用了具有本专利技术的蛋白酶识别序列的标签肽与第二标签肽组合而成的标签肽的夹心ELISA法的示意图。图3是表示在人纤连蛋白的第9-第l(Fn3结构域部分的N末端附加有各种TEV 序列的标签肽融合蛋白的图。图4是表示对单克隆抗体2H5的表位进行分析的结果的图。图5是表示对TEV蛋白酶的识别和切割所必需的氨基酸进行分析的结果的图。图6是表示通过利用Biacore的表面等离子共振分析对2H5抗体对于eTEV肽的亲和性进行分析的结果的图。图7是表示通过使用2H5抗体的蛋白免疫印迹法对eTEV标签融合蛋白进行检测的结果、和通过使用抗FLAG抗体M2的蛋白免疫印迹法对FLAG肽融合蛋白进行检测的结果的图。图8是表示从表达eTEV-NPl的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化eTEV-NPl的结果的图。图9是表示从表达eTEV-EGFP的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化eTEV-EGFP的结果的图。图10是表示从表达hGH-eTEV-Sema6C的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有 2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化hGH-eTEV-sema6C的结果的图。图11是表示从表达Sema3A-eTEV的HEK293T细胞的培养上清中，使用固定有2H5 抗体的琼脂糖凝胶纯化sema3A-eTEV的结果的图。图12是表示GFPuv的标签肽融合蛋白的氨基酸序列的图。图13是表示通过SDS凝胶电泳对使用固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶纯化的 eTEV-GFPw进行分析的结果的图。图14是表示对固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶上结合的eTEV_GFPuv的洗脱条件(竞争性的肽浓度)进行研究的结果的图。图15是表示对固定有2H5抗体的琼脂糖凝胶上结合的eTEV_GFPuv的洗脱条件(缓冲液的种类)进行研究的结果的图。图16是表示靶标签与eTEV标签结合的双标签的氨基酸序列的图。图17是表示通过夹心ELISA对双标签融合蛋白进行测定的结果的图。图18是表示双标签融合蛋白用表达载体ρ⑶-NW3的结构的图。图19(a)是表示自分泌运动因子(autotaxin)高表达株的一次筛选结果的图。图19(b)是表示自分泌运动因子高表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高木淳一，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：