本发明专利技术提供HER2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用。将含有HER2胞外区Domain 2/3之间374-398位氨基酸的多肽，序列如SEQ ID NO.5，与载体蛋白偶联免疫小鼠制备获得多株杂交瘤细胞分泌可以特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有中和活性的单克隆抗体。本发明专利技术提供了上述多肽在制备HER2单抗及治疗以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。本发明专利技术的单抗与HER2结合的亲和力介于1-4nM，结合到肿瘤细胞表面的HER2后，能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导HER2内吞，成为非常理想的生物靶向治疗抗体，将本发明专利技术的单抗与曲妥珠或帕妥珠联合用药，可增强治疗效果，具有显著的市场价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域及抗体制备技术，具体地说，涉及抗HER2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用。
技术介绍
人表皮生长因子受体2(HER2)是表皮生长因子受体(ErbB2)家族中的一员，是相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。作用于HER-2靶点的药物，是目前治疗乳腺癌最常用最有效的药物，主要有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等。基因泰克公司早在1997年就上市了第一个针对乳腺癌标志物HER2的抗体药物赫赛汀(Herceptin，注射用曲妥珠单抗)，每年销售额可达50多亿美元，目前成为仿制药的热点。2012年基因泰克又推出一种针对HER-Domain2位点的抗体药，与赫赛汀联合使用治疗效果更佳。2013年3月，基因泰克又上市了赫赛汀和药物DM1偶联物，对癌症晚期病人也有非常好的疗效。如果能开发出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗原位点不同的新的单抗药物，不仅有利于打破垄断，降低现有药物的市场份额，降低癌症治疗成本，还有利于丰富治疗癌症的抗体药物种类，与现有药物联合用药、增加疗效并巩固治疗效果。但目前还没有针对Domain2/3位点的单抗药物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供针对与曲妥珠单抗识别表位不同的人表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体及其应用。本专利技术提供的HER2线性表位中和活性单克隆抗体是以HER2氨基酸序列第374-398的多肽偶联到KHL载体蛋白作为免疫原免疫小鼠后，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有生物学活性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。上述用于免疫小鼠的多肽序列为：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。本专利技术提供了人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备HER2线性表位中和活性单克隆抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术提供了人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术将上述多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别HER2蛋白的多肽序列，共获得40个阳性克隆，复筛筛选出6个阳性克隆，进一步中和活性试验筛选出2个阳性克隆，将这两个单克隆抗体分别称之为clone2H4和clone2D9。本专利技术提供了HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术提供了产生单克隆抗体clone2H4的杂交瘤细胞。本专利技术提供了单克隆抗体clone2H4在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。本专利技术提供了含有单克隆抗体clone2H4的药物、检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供了HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2D9，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。产生单克隆抗体clone2D9的杂交瘤细胞属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了单克隆抗体clone2D9在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。含有单克隆抗体clone2D9的药物、检测试剂或试剂盒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供抗HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4或clone2D9的制备方法，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain2/3之间第374-398位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得。其中，所述多肽的氨基酸序列为：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的多肽序列，偶联至KLH载体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。优选地，上述多肽序列选自HER2：含有SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。本专利技术提供的HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4和clone2D9具有良好的亲和力，实验表明，clone2H4和clone2D9与HER2阳性细胞SK-BR-3细胞的亲和力EC50为1-4nM。能够结合到SK-BR-3细胞表面HER2，有效地抑制乳腺癌细胞的增值生长，且诱导HER2内吞，可以成为非常理想的生物靶向治疗抗体。此外本专利技术的单克隆抗体识别的是一个在HER2胞外区Domain2/3之间序列的一个线性表位，与帕妥株单抗和曲妥珠单抗的识别HER2表位完全不同，可以和它们二者联合用药，增强治疗效果，在乳腺癌的治疗中有着广阔的前景。附图说明图1为本专利技术实施例1通过间接ELISA法筛选识别HER2的阳性克隆，其中筛选了600个克隆，阳性克隆178个，挑选较好的40个阳性克隆进行下一步复筛。图2是本专利技术实施例2中单抗的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，clone2H4和clone2D9分别为本专利技术获得的两个单克隆抗体；图3A和图3B分别为clone2H4和clone2D9结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，显示能够结合到SK-BR-3细胞表面。图4A为本专利技术实施例4中clone2H4结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，clone2H4的抑制效果达到40％；图4B为clone2D9结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，clone2D9的抑制效果达到30％，均显示良好的中和活性。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1产生clone2H4和clone2D9的杂交瘤细胞系的建立一、实验材料1、免疫原：以HER2作为靶蛋白，从中选取一段多肽序列(HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽)，序列如下：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。采用化学合成的方式制备上述多肽，纯度要求大于90％。将多肽与KLH偶联制备成免疫原。2、培养基：DMEM培养基购自Hyclone公司，HAT、HT选择培养基、降植烷购自sigma公司。3、实验动物：Balb/c小本文档来自技高网...
【技术保护点】
人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备HER2线性表位中和活性单克隆抗体中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备HER2线性表位中和活性单克隆抗体中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备多肽疫苗中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。3.人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。4.HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4，其特征在于，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。5.产生权...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙乐，李茂华，张翠娟，张小刚，王慕旸，
申请(专利权)人：北京天成新脉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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