低免疫原性抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及低免疫原性抗TNF‑α人源化单克隆抗体TCX063及其应用。本发明专利技术提供抗TNF‑α人源化单克隆抗体TCX063，其为通过改造英孚利昔单克隆抗体的FR区得到的降低免疫原性的抗TNF‑α人源化单克隆抗体。本发明专利技术提供的抗体与英孚利昔单克隆抗体具有相同的TNF‑α抗原结合位点，保留了英孚利昔单克隆抗体的抗原亲和力和特异性，但其免疫原性显著低于英孚利昔单克隆抗体。低免疫原性TNF‑α抗体将降低人体内由抗体免疫原性引起的免疫反应而导致的药物副作用风险；降低了抗体药ADA；延长了抗体的体内半衰期；同时使得皮下给药的给药方式成为可能，具有极大的应用潜力和价值。

【技术实现步骤摘要】
低免疫原性抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及低免疫原性抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063及其应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种由免疫细胞分泌、在炎症和免疫应答中自然分泌的细胞因子。研究显示，TNF-α在多种慢性疾病(如克罗恩氏病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等)的患者体内含量有上调的趋势(例如，在类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜液中，TNF-α水平升高)，并在病理性炎症和关节破坏等过程中发挥重要作用。人TNF-α分子量为17kDa，在体内可以单体或三聚体形式存在，其活性形式为三聚体。TNF-α通过与细胞表面受体p55和p75相互作用以发挥生物活性功能。目前，一般采用单克隆IgG抗体或者可溶性的TNF-α受体中和体内的TNF-α。目前市售的以TNF-α为靶点的单克隆抗体主要包括依那西普、英孚利昔、阿达木和赛妥珠等，其中依那西普是由两条人TNF-α受体(p75)偶联到Fc端的融合蛋白；英孚利昔是人源化的TNF-α鼠单克隆抗体，阿达木单克隆抗体是人源化的TNF-α抗体。利用放射性标记的TNF-α进行结合能力测定，结果表明：英孚利昔能够结合单体(无活性)及三聚体(有活性)类型的可溶TNF-α；依那西普更倾向于结合有活性的聚体形式的TNF-α及TNF-β，而阿达木单克隆抗体则只结合TNF-α，而不结合TNF-β。英孚利昔(Infliximab)单抗是杨森生物技术(JanssenBiotech)(原森托科尔公司(CentocorCorporation))开发的一种具有鼠类抗TNF-α的可变区结构域和人IgG恒定区结构域的嵌合抗体，可特异性地与TNF-α结合并阻断TNF-α与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用。Infliximab单克隆抗体在宿主体内免疫原性较强，高达35％以上的患者使用该单克隆抗体会产生免疫反应。免疫反应可能引起免疫复合物介导的抗体或片段从循环中清除，并导致反复投药不适用于治疗，从而降低患者的治疗效益且限制抗体的再投予。同时，由于免疫原性较高，英孚利昔单克隆抗体需要通过静脉注射的方式给药，相较于皮下给药的阿达木等单克隆抗体，对于操作者及给药环境的要求更为苛刻，且给药方式更为复杂，而且药物通过静脉注射方式给药往往半衰期较短。然而，目前尚没有关于低免疫原性TNF-α的抗体的报道。因此，亟需开发在保证高亲和力和特异性的同时具有低免疫原性的抗TNF-α抗体。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体、其制备方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术通过利用商品化的DNAstarTM对英孚利昔单克隆抗体的氨基酸序列进行分析，结果发现，英孚利昔单克隆抗体的免疫原性系数为16.4，具有较高的免疫原性。通过对人抗体基因库中所有轻链和重链的框架区(Frameworkregion，FR)进行序列比对分析，筛选与英孚利昔单克隆抗体的序列同源性高且免疫原性相对较低的抗体FR区段。采用筛选得到的FR区替换英孚利昔单克隆抗体的对应的区段；对替换后得到的氨基酸序列进行3D建模，并与原始英孚利昔单克隆抗体进行结构比对，选择与英孚利昔单克隆抗体构象较为接近的抗体氨基酸序列作为低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体的筛选靶标，通过抗体表达、抗体的亲和力、特异性以及免疫原性的分析等实验筛选，最终得到在保持英孚利昔单克隆抗体的亲和力和特异性的同时具有低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体。本专利技术的第一个目的在于提供一种抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其为通过改造英孚利昔单克隆抗体的FR区得到的降低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体，所述英孚利昔单克隆抗体的轻链全长的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重链全长的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR1区的氨基酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示；所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR3区的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示；所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR1区的氨基酸序列如SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示；所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR3区的氨基酸序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示。所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063具有结合人TNF-α并阻断人TNF-α与TNF受体结合的功能。作为优选，所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链可变区的氨基酸序列选自如SEQIDNO.13～16所示的氨基酸序列中的任意一种，重链可变区的氨基酸序列选择如SEQIDNO.17～21所示的氨基酸序列中的任意一种。具有上述轻链和重链可变区序列的抗TNF-α人源化单克隆抗体具有较高的亲和力、特异性，同时具有相对较低的免疫原性。在具有上述轻链可变区和重链可变区组合的抗体中，筛选得到11个表达量、亲和力、特异性和免疫原性性能较优的单克隆抗体，这11个单克隆抗体均具有与英孚利昔单克隆抗体相同的抗原结合位点，同时保持了与英孚利昔单克隆抗体相近的表达量以及与人TNF-α结合的亲和力，可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合；同时通过对抗体FR区的优化，使得这些抗体的免疫原性得到有效的降低。本专利技术中，上述11个低免疫原性的人源化抗TNF-α的单克隆抗体，分别命名为H1L0、H1L1、H1L2、H2L0、H2L1、H2L2、H2L3、H2L4、H3L2、H3L4、H5L1。上述11个低免疫原性的人源化抗TNF-α的单克隆抗体具有如下任意一种可变区氨基酸序列：(1)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；(2)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；(3)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；(4)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；(5)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；(6)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；(7)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；(8)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；(9)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其特征在于，其为通过改造英孚利昔单克隆抗体的FR区得到的降低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体；所述英孚利昔单克隆抗体的轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；/n所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；/n所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6或SEQ ID NO.7所示；/n所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示；/n所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示；/n所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063具有结合人TNF-α并阻断人TNF-α与TNF受体结合的功能。/n

【技术特征摘要】
20190507 CN 20191037685381.一种抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其特征在于，其为通过改造英孚利昔单克隆抗体的FR区得到的降低免疫原性的抗TNF-α人源化单克隆抗体；所述英孚利昔单克隆抗体的轻链全长的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重链全长的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR1区的氨基酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链FR3区的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR1区的氨基酸序列如SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的重链FR3区的氨基酸序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063具有结合人TNF-α并阻断人TNF-α与TNF受体结合的功能。


2.根据权利要求1所述的抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其特征在于，所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063的轻链可变区的氨基酸序列为选自如SEQIDNO.13～16所示的氨基酸序列中的任意一种，重链可变区的氨基酸序列为选自如SEQIDNO.17～21所示的氨基酸序列中的任意一种。


3.根据权利要求1或2所述的抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其特征在于，所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063具有如下任意一种氨基酸序列：
(1)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；
(2)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；
(3)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示；
(4)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；
(5)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；
(6)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；
(7)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；
(8)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示；
(9)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.19所示；
(10)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.19所示；
(11)轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.21所示。


4.根据权利要求1～3任一项所述的抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063，其特征在于，所述单克隆抗体TCX063为人IgG1全抗体；
优选地，所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063具有如下任意一种氨基酸序列：
(1)轻链的氨基酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙乐，任文林，
申请(专利权)人：北京天成新脉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11