【技术实现步骤摘要】
一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及一种单克隆抗体的制备方法，尤其涉及一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
再生家族基因（Reg）家族的异常表达与人类的炎症反应和肿瘤等多种疾病有密切联系，特别是消化系统疾病。临床上，经常能在肿瘤病人的病理标本和血清中检测到异常增高的Reg蛋白，因此Reg蛋白可以作为预测肿瘤进程和进展，特别是消化系统肿瘤的临床标志物，同时也可以作为诊断的标记和治疗的靶基因。Reg1是Reg基因家族的I型子类成员，Fukui等发现Reg1在胃癌组织中的表达可达37.3%，Reg1阳性患者比阴性患者有更高的增殖细胞核抗原指数；Reg1的表达与淋巴管浸润有关。Yonemura等认为Reg1α基因可作为胃癌的预后指标，其表达与胃癌的浸润性生长及高分化腺癌的血行转移密切相关。最近，来自英国和西班牙的科学家又开发出了针对胰腺导管腺癌一种新型尿检方法，检测了约500例尿样，并最终确定LYVE1、REG1α和TFF1三种蛋白可以作为潜在检测指标，这一检测方法的准确率可以达到90...
【技术保护点】
1.一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：/n⑴制备免疫接种的小鼠：/n取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍；/n⑵将X-63小鼠细胞系、...
【技术特征摘要】
1.一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
⑶按第三次免疫蛋白的剂量将REG1α蛋白溶解后向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1mL：30mL加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，充分分散后离心去上清液，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1mL：2mL加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，根据细胞生长情况从第六天开始，每隔2~3天用每孔100μLHAT液换液一次；
当孔中出现杂交细胞集落，达到每个细胞集落细胞数30~50个时即可每孔取培养上清液100μL进行抗REG1α蛋白抗体的检测；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至检测培养上清的抗REG1α蛋白抗体阳性，则确定为所需的杂交瘤细胞；
⑻单抗的筛选分离：
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板...
【专利技术属性】
技术研发人员：连晓雯，龚真莉，赵晓虹，霍锋，李恩善，王凯莉，
申请(专利权)人：甘肃智选生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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