CADM1 v9识别抗体制造技术

本发明专利技术提供识别细胞粘附分子CADM1的v9片段的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CADM1v9识别抗体
本专利技术涉及CADM1v9识别抗体。
技术介绍
小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)是代表性的难治癌症，其占日本肺癌的约15％，年死亡1万人以上。SCLC虽然对作为首次化疗的抗癌剂应答良好，但之后必然会出现抗癌剂耐受性肿瘤。而且，小细胞肺癌从早期就开始向全身转移，并且缺乏作为灵敏的病情标志物的肿瘤检测用标志物，因此其5年生存率低至不足10％，预后不良。对于SCLC的治疗而言，用于抗癌剂效果判定和复发诊断的肿瘤检测用标志物是必需的，为此在使用神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胃泌素释放肽前体(ProGRP)。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Kikuchi等，CancerScience,2012,103(6):1051-1057非专利文献2：Shirakabe等，ScientificReports,2017,7:46714非专利文献3：Nagara等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2012,417(1):462-467
技术实现思路
专利技术所要解决的课题然而，即使已对SCLC检测方法中的灵敏度进行了最优化，NSE的灵敏度仍为约30％以下，ProGRP的灵敏度仍为45％左右。因此，使用这两种标志物仍无法检测出的SCLC占整体的一半左右，这两种标志物成为了SCLC诊断和治疗的盲点。尤其是在早期SCLC中，NSE完全不能检测出肿瘤，ProGRP仅能检测出极少数肿瘤。因此，非常期待开发出能够检测出现有肿瘤标志物无法检测到的SCLC、进而还能检测出早期SCLC的新型肿瘤标志物。因此，本专利技术要解决的问题是提供SCLC的新型肿瘤标志物。用于解决课题的手段首先，本申请的专利技术人为了解决上述问题而反复进行深入研究，结果发现：细胞粘附分子CADM1在SCLC中高水平表达剪切变体v8/9，以及，该剪切变体v8/9在正常组织中于精巢中表达；CADM1v8/9的表达促进SCLC细胞的悬浮性增殖、促进在小鼠中的致瘤性，另一方面，通过抑制其表达，成球能力、存活、增殖均被抑制(非专利文献1)。此外，CADM1v8/9将被ADAM17切割而导致胞外区作为片段游离(非专利文献2)，CADM1v8/9的特征性外显子9所编码的氨基酸序列紧贴细胞膜而被包含在游离片段中。另一方面，在精巢以外的正常组织(例如上皮细胞)中，CADM1将被ADAM10切割而导致胞外区作为片段游离(非专利文献3)，但因CADM1v8/9完全不表达，因此CADM1v8/9的特征性外显子9所编码的氨基酸序列不会紧贴细胞膜、也不会被包含在游离片段中。并且，能从精巢游离出的CADM1v9片段难以转移到血液等中，据此，本申请的专利技术人发现CADM1的v9片段有望作为SCLC诊断中的特异性分子标志物。然而，使用哺乳动物来制备抗CADM1抗体非常困难。人的CADM1蛋白与哺乳类实验动物(小鼠、兔等)的CADM1蛋白同源性高，而且在正常个体的血液中存在有CADM1片段，因此即使用人的CADM1蛋白对哺乳类实验动物进行免疫，也得不到抗体。因此，长期以来难以制备能特异性识别CADM1的v9片段的抗体。本申请的专利技术人发现，通过准备将CADM1基因缺陷小鼠与Balb/c品系进行2年以上回交所获得的小鼠、用CADM1的v9片段对该小鼠进行免疫，能够制备出CADM1的v9片段的特异性抗体，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]抗体，其识别CADM1的v9片段。[2]根据[1]所述的抗体，其中，所述CADM1的v9片段是人CADM1的v9片段。[3]根据[1]或[2]所述的抗体，其识别序列号2所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列来源于为DTTATTEPAVH的CADM1的外显子9。[4]抗体，其包含：包含序列号3所示氨基酸序列的重链CDR1、和包含序列号4所示氨基酸序列的重链CDR2、和包含序列号5所示氨基酸序列的重链CDR3、和包含序列号6所示氨基酸序列的轻链CDR1、和包含序列号7所示氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号8所示氨基酸序列的轻链CDR3。[5]抗体，其包含：包含序列号9所示氨基酸序列的重链；和包含序列号10所示氨基酸序列的轻链。[6]肿瘤检测用标志物，其包含[1]～[5]中任一项所述的抗体。[7]根据[6]所述的肿瘤检测用标志物，用于检测与CADM1的v9片段相关的肿瘤。[8]根据[6]或[7]所述的肿瘤检测用标志物，其中，与CADM1的v9片段相关的肿瘤是小细胞肺癌。[9]根据[6]至[8]中任一项所述的肿瘤检测用标志物，其中，以血清、血浆、胸水中的任一者作为生物试样。[10]肿瘤检测用试剂盒，其包含[1]至[5]中任一项所述的抗体、或[6]至[9]中任一项所述的肿瘤检测用标志物。[11]根据[10]所述的肿瘤检测用试剂盒，其中，将所述抗体或所述肿瘤检测用标志物用于ELISA法、CLEIA法、荧光抗体法、酶抗体法、Western印迹法、免疫沉淀法中的任一者。[12]肿瘤检测方法，其使用[1]至[5]中任一项所述的抗体、[6]至[9]中任一项所述的肿瘤检测用标志物、或[10]或[11]所述的肿瘤检测用试剂盒来检测肿瘤。专利技术效果通过本专利技术，可以提供SCLC的新型肿瘤标志物。附图说明图1显示了CADM1剪切变体v8/9的mRNA和蛋白质的结构示意图。图2显示了对细胞培养上清液中的CADM1的v9片段的检测结果。图3显示了对肺癌和炎症性肺病患者血清中的CADM1的v9片段的检测结果。图4显示了对SCLC患者血清中的ProGRP和CADM1的v9片段的比较。图5显示了SCLC治疗效果和CADM1的v9片段量的相关性。图6显示了CADM1的外显子8和9所编码的氨基酸序列以及蛋白酶切割位点。图7显示了对SCLC患者胸水中的CADM1的v9片段的检测结果。图8显示了CADM1的v9片段的纯化蛋白的获取结果。图9显示了抗CADM1v9抗体的表位筛选结果。图10显示了F1222抗体重链和轻链的氨基酸序列和碱基序列。图11显示了E9919抗体重链和轻链的氨基酸序列。图12显示了E9935抗体重链和轻链的氨基酸序列。具体实施方式通过具体实施方式来更具体地说明本专利技术，但是，本专利技术不限于以下具体实施方式，可以进行各种变化来实施。本专利技术中所参考的文献中公开的内容作为参考而并入本文。(CADM1v9识别抗体)尽管长期以来难以制备CADM1的v9片段的特异性抗体，但本专利技术所涉及的抗体可识别CADM1的v9片段。尤其是，本专利技术所涉及的抗体能够识别CADM1的胞外区经蛋白酶(ADAM10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗体，其识别CADM1的v9片段。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180316 JP 2018-0494351.抗体，其识别CADM1的v9片段。


2.根据权利要求1所述的抗体，其中，CADM1的v9片段是人CADM1的v9片段。


3.根据权利要求1或2所述的抗体，其识别序列号2所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列来源于为DTTATTEPAVH的CADM1外显子9。


4.抗体，其包含：
包含序列号3所示氨基酸序列的重链CDR1、和
包含序列号4所示氨基酸序列的重链CDR2、和
包含序列号5所示氨基酸序列的重链CDR3、和
包含序列号6所示氨基酸序列的轻链CDR1、和
包含序列号7所示氨基酸序列的轻链CDR2、和
包含序列号8所示氨基酸序列的轻链CDR3。


5.抗体，其包含：
包含序列号9所示氨基酸序列的重链；...

【专利技术属性】
技术研发人员：村上善则，伊东刚，浜洼隆雄，岩成宏子，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP