检测DNA芯片假阳性、假阴性杂交信号的新方法技术

本实用新型专利技术公开了一种检测ＤＮＡ芯片假阳性、假阴性杂交信号的新方法。它是将ＤＮＡ芯片放置于温控杂交盒中，加入含待测靶基因的杂交液于杂交盒内，按需设置芯片的杂交温度和时间，漂洗温度和时间，由计算机控制定时对杂交荧光信号进行扫描，利用荧光显微镜或共聚焦显微镜记录几个不同温度下ＤＮＡ芯片的荧光图像。本发明专利技术的优点：可以检测出ＤＮＡ芯片杂交信号中的假阳性、假阴性信号，提高ＤＮＡ芯片检测结果的准确性，还可以缩短检测时间，实验简单易行。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测DNA芯片假阳性、假阴性杂交信号的方法。现有技术中，DNA芯片采用同一温度、一次性杂交，然后利用荧光显微镜(或共聚焦显微镜、DNA芯片专用扫描仪)检测DNA芯片的各个探针区域的荧光强度。通过给定的荧光强度的域值来判断杂交信号的有无或高低。如某一区域的荧光强度高于域值，则认为该区域的荧光信号为阳性信号；如低于域值，则认为是阴性信号。如美国AFFYMATRIX公司的GenChip系统(http//www.affymatrix.com)。其具体实验方法如下1.利用化学方法把特异性寡核苷酸链固定于玻璃片或硅片上。2.荧光标记的待测靶基因溶解于杂交液中；然后把杂交液铺满于DNA芯片上，在一定温度下杂交一段时间。3.在一定温度下洗去未杂交的靶基因及非特异性吸附的靶基因。4.在荧光检测仪器上获得DNA芯片上的荧光图像。5.利用计算机图像分析软件，计算不同区域的荧光强度积分值。按预先确定的积分荧光强度域值，给出阳性信号区域。如上所述，这种DNA芯片的杂交方法和信号检测方法存在以下几个方面的问题1.由于DNA芯片的寡核苷酸探针的碱基组成不同，因而其最适杂交温度也不相同(不同探针的最适杂交温度可能有较大差别)。因此，即使是每一个探针区域的探针分子数目相同，所形成杂交双链的数目也可能不同，导致不同区域的荧光强度不同。2.同一温度下的杂交可能产生不完全匹配的靶基因与DNA芯片上的探针结合，形成假阳性信号。3.由于DNA芯片上的寡核苷酸探针的杂交温度不在最适杂交温度范围，可能使某些完全匹配的靶基因不能形成或很少形成杂交双链，从而产生假阴性信号。这些情况将使DNA芯片的信号判断带来一定的难度，也影响DNA芯片检测结果的准确性(有关讨论见J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1993年)。本专利技术的目的是针对以上不足，提出利用梯度温度杂交、动态扫描技术，实时、原位获得DNA芯片上的寡核苷酸探针与靶基因杂交的荧光图像的检测DNA芯片假阳性、假阴性杂信号的新方法。为了达到上述目的，本专利技术采取下列措施检测DNA芯片假阳性，假阴性杂交信号的新方法是将DNA芯片放置于温控杂交盒中，加入含待测靶基因的杂交液于杂交盒内，按需设置芯片的杂交温度和时间、漂洗温度和时间，由计算机控制定时对杂交荧光信号进行扫描，利用荧光显微镜或共聚焦显微镜记录几个不同温度下DNA芯片的荧光图像，当杂交完成后，增加DNA芯片的溶液温度检测双链解链速度，如果所有温度下，某一区域荧光强度均低于某一域值，则认为该区域的信号为阴性信号；如在某一温度下荧光强度高于域值，则根据动态杂交曲线或动态解链曲线进行判断。本专利技术的优点第一，可以检测出DNA芯片杂交信号中的假阳性、假阴性信号，提高DNA芯片检测结果的准确性。第二，由于是观测探针与靶基因的动态杂交情况，不需要等待探针与靶基因完全结合后再检测，因此可以缩短检测时间。第三，不需要改变通用的DNA芯片检测仪器，实验简单易行。下面结合附图、实施例作详细说明附图说明图1是DNA温控杂交盒示意图；图2是DNA芯片杂交荧光图像扫描系统示意图；图3是DNA芯片动态杂交图像分析框图；图4是DNA芯片杂交荧光强度随温度变化曲线；图5是DNA芯片杂交信号归一化曲线。实施例一、实验仪器温控杂交盒它具有温度杂交盒子，盒子底层为石英玻璃3，在石英玻璃上放有DNA芯片2，探针面向下，盒子两侧设有出液(气)管5，进液(气)管4，盒子外有不透光保温材料1，该温控杂交盒由计算机控制。它可以在1分钟之内使杂交盒内的温度均匀的增加或减少1℃，另外该杂交盒还具有自动进样(含靶基因的杂交液或杂交洗液)、快速干燥功能(图1)；为了保证杂交液体能够均匀分布于DNA芯片的探针面，要求杂交液体浸没DNA芯片。温控杂交盒7固定于荧光倒置显微镜或激光共聚焦倒置显微镜8的载物台上，DNA芯片放置于杂交盒内，探针面向下。可按需要设置芯片的杂交温度、时间和漂洗时间、温度，经监视器11，由计算机10通过显微镜控制系统9、杂交温控系统6定时对杂交信号进行扫描(图2)。二、实验材料和方法标准的显微镜玻片(BDH，76.2mm×25.4mm×1mm)，利用共价结合方式把单链DNA探针固定于玻璃表面(具体方法参见Uwe Maskos，Ewin M..Southern.Parallel analysis of oligodeoxyribonucleotide(oligonuleotide)interactions.I.Analysis of factors influenceing oligonucleotide duplex formation.NucleicAcids Research，199220(7)1675-1678)。杂交溶液Tetramethylammonium chloride(TMAC1，Aldrich)溶解于蒸馏水中，配置成5M溶液，加入Charcoal(BDH)，搅拌后过滤，最终配置成5MTMACI，50mM Tris-HCl(pH8)，2mM EDTA，1mg/ml SDS。DNA探针(23mers)与靶基因(200mers)固定于玻片上的探针5’-AGCTGTAGTCCATGTTAGACGTG-3’一玻璃表面与探针A完全匹配靶基因序列 3’-X-TCGACATCAGGTACAATCTGCAC-Y-CY5-5’不完全匹配靶基因序列(中间)3’-X-TCGACATCAGATACAATCTGCAC-Y-CY5-5’不完全匹配靶基因序列(5’端)3’-X-TCGACATCAGGTACAATCTGCAγ-Y-CY5-5’固定于盖玻片上的探针(B)5’-TGACTGTGTGCGATGTAAATGGC-3’-玻璃表面与探针B完全匹配靶基因序列3’-X-ACTGACACACGCTACATTTCCG-Y-CY5-5’其中X、Y为脱氧核糖核酸，X+Y＝177，CY5为靶基因上所挂荧光探针。三、实验数据获取方法(1)动态杂交图像记录根据实验要求，确定杂交温度的变化范围和变化速率，由计算机控制杂交液的进样体积和时间。杂交盒内温度由低到高如分别设定35℃、40℃、45℃，加入含有靶基因的杂交液体，35℃杂交一段时间后，对DNA芯片进行漂洗，去除未结合探针，并加入气体干燥；利用荧光显微镜或共聚焦显微镜记录DNA芯片35℃时杂交的荧光图像12。然后在40℃重新加入相同的体积的含靶基因的杂交液，重复上述过程获得40℃时杂交的图象13。依次类推，可获得45℃时的杂交图象14。这样就获得一系列不同温度下的DNA芯片杂交荧光图像(图3A)。(2)动态解链荧光图像记录当上述实验完成后，加入不含荧光探针的杂交液，进行高温条件下使DNA芯片上的杂交双链解链。杂交盒温度变化速率为1℃/min，每隔30秒利用激光共聚焦显微镜快速扫描DNA芯片，获得该温度下的DNA芯片的荧光图像。三、数据处理方法(1)动态杂交图像分析通常情况下，同一探针完全匹配靶基因的杂交荧光信号高于不完全匹配靶基因的荧光杂交信号。因此，可利用图像分析软件(自编)，对不同温度下同一DNA芯片的每个区域的荧光强度进行积分，获得各个区域的积分荧光强度(图4)。通过设本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ＤＮＡ芯片假阳性，假阴性杂交信号的新方法，其特征在于将ＤＮＡ芯片放置于温控杂交盒中，加入含待测靶基因的杂交液于杂交盒内，按需设置芯片的杂交温度和时间，漂洗温度和时间，由计算机控制定时对杂交荧光信号进行扫描，利用荧光显微镜或共聚焦显微镜记录几个不同温度下ＤＮＡ芯片的荧光图像，当杂交完成后，增加ＤＮＡ芯片的溶液温度检测双链解链速度，如果所有温度下，某一区域荧光强度均匀低于某一域值，则认为该区域的信号为阴性信号；如在某一温度下荧光强度高于域值，则根据动态杂交曲线或动态解链曲线进行判断。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦甦，雷国华，
申请(专利权)人：杨梦甦，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]