本发明专利技术公开了一种能鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。该试剂盒针对新城疫病毒F基因设计6条引物，经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明专利技术方法灵敏度高，特异性好，既能检测出目前流行的新城疫基因Ⅶ型流行毒株感染，又能判断是否是Lasota疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围新城疫疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴别新城疫“3013疫苗毒株和基因训型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒
本专利技术涉及一种鉴别新城疫匕80仏疫苗毒株和基因训型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断
。
技术介绍
新城疫(他机狀丨匕(11862186，冊)是严重危害禽类的病毒性传染病之一，是我国法定的一类动物疫病。新城疫病毒(^61(^81:16 (1186886卩11~118，冊V)属副黏病毒科、腿腺炎病毒属有囊膜，具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成分。病毒核酸类型为单股、负链、不分节段的I？嫩。在冊V基因组上依次排列着册、 圆和I基因，分别编码核衣壳蛋白(册?、磷蛋白(口)、基质蛋白⑶)、融合蛋白(口)、血凝素-神经氨酸酶(圆)和大分子蛋白化)，其中？、圆蛋白与冊乂致病性密切相关。 目前，虽然国内养禽场对新城疫的预防极为重视，但新城疫的流行仍频繁发生，损失巨大。因此，及早诊断、尽快控制新城疫对减少经济损失有重要意义。在我国国家标准《新城疫诊断技术》((^8/116550-2008)中，诊断方法有临床诊断、病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验和反转录-聚合酶链式反应(814(?)。其中临床诊断只能初步诊断，确诊方法中病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验均需进行病毒分离，耗时较长，不适应临床快速诊断的要求。奶-？0？技术具有灵敏度高、特异性好、快速准确的优点，十分适合养殖场快速定性诊断的需要。但是，由于我国饲养的禽广泛应用新城疫活疫苗且免疫频率高，其中以匕80仏株应用最为广泛，导致禽群中普遍存在匕80仏疫苗毒株，用常规奶-？0？诊断方法不能确定所检测到的毒株是新城疫1^800疫苗株还是流行毒株，为临床诊断造成极大困难。 为了解决鉴别诊断疫苗毒和流行毒这一问题，国内外学者做了大量的探索工作。1989年，0611^0^等用乂4株建立了一组特异性单抗制剂，不仅能区别的自然感染和人工免疫，而且与其他副粘病毒属病毒不发生交叉反应。但是其缺点是制备难度大、成本高，且目前并无商品化应用的成熟产品。把!'641 8匕4等建立了价^杂交技术进行强弱毒株区分，设计了 2个探针，探针长21个碱基，与强毒株16^8的？蛋白裂解位点基因互补，可与11个速发性毒株、5个中发性毒株的杂交，而不能与对照的7个弱毒株八杂交。但由于八杂交技术操作繁琐，难度大，难以在普通实验室进行，亦无商品化产品可以应用，目前仍停留在实验室研究阶段。孙军峰等根据基因训型新城疫病毒？基因裂解位点特征设计一对引物和探针，建立的基因VII型毒株荧光定量814(?鉴别检测方法，特异性良好，最低可检测到100拷贝/微升的模板咖八。但该方法的缺点是成本高，实验设备要求高，普通实验室无法使用且灵敏度稍低。 近年来，我国新城疫的流行特点出现了明显变化，流行毒株以基因训型为主，非典型性新城疫多发，对我国养禽业造成了巨大损失。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本专利技术的目的旨在提供一种用于鉴别新城疫匕80仏疫苗毒株和基因训型流行毒株的诊断试剂盒。 实现上述专利技术目的的技术方案是一种鉴别新城疫匕80仏疫苗毒株和基因训型流行毒株的诊断试剂盒，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成；所述反转录混合液由处理灭菌水、2.5111 11101 ?5 X ^ 811打61~、25 911101.[-1丽-1？上游引物、51/ 111歷反转录酶和侧/ 111 I歷酶抑制剂组成；每个反应体积比为10:4:4:1:0.5:0.5，共计20 50个反应共计1000 ^匕装成1管； 所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10父？0？51119 11101.11 冊乂-1？上游引物、25 1111101 ? 1^1冊乂-卟下游引物、5口/111 1*1叫0嫩聚合酶组成，每个反应体积比为17:2.5:2:0.5:0.5:0.5，共计23 ^ 1,50个反应共计1150 9匕装成1管；所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10父？0？ 811 打6；^、2.5111911101.11 冊乂-2？上游引物、25 0 11101吨―1冊乂-21？下游引物、冊乂-3？上游引物、25 ^ 11101吨―1冊乂-3尺下游引物、5口1*1'叫0嫩聚合酶组成，每个反应体积比为16:2.5:2:0.5:0.5:0.5:0.5:0.5，共计23 50个反应共计1150 ^匕装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，每个反应需对照250^匕50个反应共计12500^匕分装 10管，每管 1250 9 I ；所述阳性对照为匕80仏疫苗株鸡胚培养尿囊液，每个反应需对照250 ^ 1, 50个反应共计 12500 111,分装 10 管，每管 1250 9 I ； 所述的引物冊[卟序列为:5’ - 60X^0X0061X6006^01 -3’所述的引物冊[卟序列为:5’ - ^601X6X^X^60^60X6 -3’ 所述的引物冊12？序列为:5’ - ^16660100^001X0X^0 -3’ 所述的引物冊序列为:5’ - 01600^01601^611616^1 -3’ 所述的引物冊13？序列为:5’ - ^00X06^66^666^6001 -3’ 所述的引物冊[38 序列为:5’ - 1^606^1^110^600^1^0 -3’。 本专利技术所述的诊断试剂盒可快速、灵敏、准确、特异的鉴别新城疫匕如仏疫苗毒株和基因训型流行毒株，能够直接从组织病料、喉头拭子、血清或全血、粪便等临床样本进行检测诊断，为家禽生产保驾护航。 本专利技术提供上述试剂盒鉴别检测新城疫匕80仏疫苗毒株和基因训型流行毒株的方法，包括以下步骤:1)1^120106叫6社试剂法提取待检样品总I？嫩，空气中自然干燥；2)取反转录混合液20^ 1,充分吹吸溶解总价^，42 I水浴反转录90旧!!，取出置-20I下保存备用；3)取一扩混合液23^ 1,加入反转录产物2 ^ 1,混合均匀进行扩增，反应条件为95预变性5 111111，然后依次为94 I，50 8 ；5200 ,60 8 ；72 I，60 8 ；共进行35个循环， 最后72延伸10 111111 ；4)取二扩混合液23^匕加入一扩产物2^匕混合均匀进行？(?扩增，反应条件为95V预变性5 111111，然后依次为94 I，50 8 ；55 V ,60 8 ；72 V ,60 8共进行35个循环，最后72延伸10 111111 ； 5)10 8 - 1^1琼脂糖凝胶中电泳；6)结果分析:阴性对照不出条带，阳性对照出526恥、199恥两个条带，说明对照成立，样品中出现526恥一个条带，即为新城疫基因训型流行毒株感染，样品出526如、199恥两个条带，即为匕如仏疫苗毒株。 试剂盒的验证性试验①特异性试验使用本专利技术的诊断试剂盒，提取匕如仏疫苗毒株、勵V 3X1^株(咸阳职业技术学院动物疫病分子生物学诊断实验室分离保存，测序分析为基因训型流行毒株?、187、八IV冊、181^和八―总觀八，按本专利技术所述方法进行反转录-套式复合扩增完毕后电泳观察。结果显示匕180^1疫苗毒株出现526如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因Ⅶ型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成；所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mol·L‑1dNTP、5×AMV Buffer 、25 μmol·L‑1 NDV‑1F上游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10：4：4：1：0.5：0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L‑1dNTP、25 μmol·L‑1 NDV‑1F上游引物、25 μmol·L‑1 NDV‑1R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17：2.5：2：0.5：0.5：0.5，共计23 μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L‑1dNTP、25 μmol·L‑1 NDV‑2F上游引物、25 μmol·L‑1 NDV‑2R下游引物、NDV‑3F上游引物、25 μmol·L‑1 NDV‑3R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为16：2.5：2：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5，共计23 μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，每个反应对照为250μL，50个反应共计12500μL，分装成10管，每管为1250μL；所述阳性对照为Lasota疫苗株鸡胚培养尿囊液，每个反应对照为250μL，50个反应共计12500μL，分装成10管，每管为1250μL；所述的引物NDV‑1F序列为：5’‑ GCTAACTCCGTTGCCGACT ‑3’；所述的引物NDV‑1R序列为：5’‑ AAGCTTGTATAAAGCAGCTG ‑3’；所述的引物NDV‑2F序列为：5’‑ ATGGGCYCCAGACCTTCTAC ‑3’；所述的引物NDV‑2R序列为：5’‑ CTGCCACTGCTAGTTGTGAT ‑3’；所述的引物NDV‑3F序列为：5’‑ ACCTCGAGGAGGGAGCCT ‑3’；所述的引物NDV‑3R序列为：5’‑ TAGCGATATTCAGCCATAC ‑3’。...
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别新城疫Lasota疫苗毒株和基因VII型流行毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成； 所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mo I.L_1dNTP,5XAMV Buffer、25μ mo I.Γ1 NDV-1F上游引物、5U/ μ L AMV反转录酶和40U/ μ L HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10:4:4:1:0.5:0.5，共计20 μ L，50个反应共计1000 μ L，装成I管；所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10XPCR Buffer、2.5m mol.L ΜΝΤΡ、25 μ mo I.L 1NDV-1F上游引物、25 μ mol.Γ1 NDV-1R下游引物、5U/μ L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17:2.5:2:0.5:0.5:0.5，共计23 μ L，50个反应共计1150 μ L，装成I管；所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10XPCR Buffer、2.5m mol.L ΜΝΤΡ、25 μ mol.L 1NDV-2F 上游引物、25 μ mo I.Γ1 NDV-2R 下游引物、NDV-3F 上游引物、25 μ mo I...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱小甫，吴旭锦，
申请(专利权)人：咸阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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