经修饰的蛋白酶制造技术

本发明专利技术涉及经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的蛋白酶，本发明专利技术还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。具体地，本发明专利技术涉及改变蛋白酶在微生物（例如芽孢杆菌种）中的表达的方法。本发明专利技术公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的蛋白酶，本专利技术还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。具体地，本专利技术涉及改变蛋白酶在微生物（例如芽孢杆菌种）中的表达的方法。本专利技术公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。【专利说明】经修饰的蛋白酶本申请是申请日为2008年3月12日、专利技术名称为“经修饰的蛋白酶”的中国专利申请200880007877.6 (国际申请号PCT/US2008/003291)的分案申请。专利
本专利技术提供了编码经修饰的蛋白酶的经修饰的多核苷酸以及改变微生物中蛋白酶生产的方法。具体地，本专利技术涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌种)中的表达的方法。本专利技术公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。
技术介绍
微生物，例如是芽孢杆菌属成员的革兰氏阳性微生物，已被用于大规模的工业发酵，这部分是因为它们能将其发酵产物分进其培养基。分泌的蛋白穿过细胞膜和细胞壁被输出，随后再释放进外部培养基。多肽分泌进周质空间或其培养基依赖于多个参数，在工业发酵中需要对它们详加考虑。事实上，异源多肽的分泌是工业界广泛使用的技术。典型地，用编码待表达且待分泌的目的异源多肽的核酸转化细胞，以生产大量的想要的多肽。该技术已用于生产大量的多肽。已可通过对编码想要的蛋白质的多核苷酸进行遗传操作，来控制想要的多肽的表达和分泌。虽然蛋白质生产方法已有若干进展，但是本领域中仍需要提供细胞外蛋白质分泌的有效方法。专利技术概述本专利技术涉及经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的蛋白酶，本专利技术还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。特别地，本专利技术涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌种)中的生产的方法。本专利技术公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。本专利技术涉及经过遗传操作以增强经修饰蛋白质生产的多核苷酸、多肽和细胞。特别地，本专利技术涉及具有引入其中的外源核酸序列的革兰氏阳性微生物以及在此类宿主细胞(例如芽孢杆菌属的成员)中生产蛋白质的方法。更具体地，本专利技术涉及蛋白酶的生产以及经过遗传操作从而具有改变的生产表达的蛋白质的能力的细胞。特别地，本专利技术提供了微生物对蛋白酶的增强的生产。在一些实施方式中，本专利技术提供了分离的经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的全长蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域(pro region)的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID N0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些实施方式中，经修饰的全长蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其他实施方式中，全长蛋白酶是源于野生型或变体前体碱性丝氨酸蛋白酶的碱性丝氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ IDN0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其它一些实施方式中，全长蛋白酶是源于野生型或变体前体碱性丝氨酸蛋白酶(其是克劳氏芽孢杆菌(B.Clausii)或缓慢葡萄球菌(S.1entus)碱性丝氨酸蛋白酶)的碱性丝氨酸蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些实施方式中，经分离的经修饰的多核苷酸包含SEQ ID NOS: 1、9或240所示的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本专利技术提供了经分离的经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的全长蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID N0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109，其中，所述至少一处取代是在选自SEQ ID NO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84 和 E88 的一处氨基酸位置进行的。在其它一些实施方式中，E33的氨基酸取代选自E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q和E33R。在其它一些实施方式中，E57的氨基酸取代选自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 E57N。在一些实施方式中，本专利技术提供了经分离的经修饰的多核苷酸，其包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列，所述位置等同于SEQID NO: 5、13或244的氨基酸位置28-108和109。在另外一些实施方式中，经分离的经修饰的多核苷酸还包含编码包含成熟区域的全长蛋白酶的多核苷酸，其中，编码蛋白酶成熟区域的多核苷酸与SEQ ID N0S:8、16或247有至少大约70%同一性。在一些实施方式中，本专利技术提供了包含经修饰的多核苷酸的至少一种载体，所述多核苷酸编码经修饰的全长蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109，或者，提供了包含经分离的经修饰的多核苷酸的至少一种载体，所述多核苷酸包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列，所述位置等同于SEQ ID NO:5、13或244的氨基酸位置28-108 和 109。在其它一些实施方式中，本专利技术提供了经包含本专利技术的经修饰的多核苷酸的载体转化的宿主相比。在一些优选的实施方式中，经转化的宿主细胞是微生物。例如，在一些实施方式中，本专利技术提供了下述宿主细胞，所述宿主细胞经包含经修饰的下述多核苷酸的至少一种载体转化，所述多核苷酸编码经修饰的全长蛋白酶，其中，多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变，所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109，或者，所述宿主细胞经分离的经修饰的下述多核苷酸转化，所述多核苷酸包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列，所述位置等同于SEQ ID N0:5、13或244的氨基酸位置28-108和1·09。在一些实施方式中，经本专利技术的多核苷酸转化的宿主细胞是选自芽抱杆菌属(Bacillus sp).、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)和曲霉属(Aspergillus sp.)构成的组的微生物。在一些其它实施方式中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌(B.subti I is)。在一些实施方式中，本专利技术提供了通过本专利技术的经转化的宿主细胞生产的蛋白酶。本专利技术还提供了在微生物中生产异源蛋白酶的方法，其中所述方法包含下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的全长蛋白酶，其中所述经修饰的全长蛋白酶选自SEQ?ID?NO:13并且包含选自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H、E57N和E57G之一的突变，其中所述突变导致所述经修饰的全长蛋白酶与前体蛋白酶相比具有增强的生产活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·埃斯特尔，E·费拉里，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：