一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，利用PCR扩增得到人活性颗粒酶A基因，将其插入到与原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。该工程菌经IPTG诱导后可表达人活性颗粒酶A重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式表达。利用镍亲和层析柱可以分离得到纯度高达95％以上的重组蛋白，且该重组蛋白经BLT底物溶液进行活性测定显示出较好的酶解活性。该方法具有成本低、操作简单、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白具有生物学活性和易于纯化。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，利用PCR扩增得到人活性颗粒酶A基因，将其插入到与原核表达载体pET24a(+)相应酶切位点中，构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA，经转化大肠杆菌BL21后获得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。该工程菌经IPTG诱导后可表达人活性颗粒酶A重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式表达。利用镍亲和层析柱可以分离得到纯度高达95％以上的重组蛋白，且该重组蛋白经BLT底物溶液进行活性测定显示出较好的酶解活性。该方法具有成本低、操作简单、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白具有生物学活性和易于纯化。【专利说明】一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法
本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体地涉及了一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法。
技术介绍
颗粒酶A(Granzyme A, GzmA)是一种存在于细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)及天然杀伤性细胞(Natural killer, NK)中的丝氨酸蛋白酶。颗粒酶 A主要诱导一种caspases非依赖性的细胞凋亡，它通过颗粒的胞吐作用释放，在穿孔素 (Perforin)协同作用下进入靶细胞的细胞浆中，并聚集在细胞核，通过裂解SET复合物，释放的脱氧核糖核酸酶匪232H1对染色体DNA形成单股DNA链切(缺)口而引起DNA断裂，最终引起靶细胞的凋亡。近来的大量研究发现，在一些健康捐助者的血清中检测到了颗粒酶A 的存在，而当炎症发生时，在血清和其他体液中可检测到更高水平的颗粒酶A，说明颗粒酶 A除了具有细胞毒性功能外，还可能在细胞外发挥促进炎症和降解细胞外基质的功能，从而允许细胞毒性细胞接近组织内的祀细胞，但具体机制还有待进一步研究。因此，获得具有活性的人活性颗粒酶A重组蛋白对于开展其生物学功能及分子机制的研究具有重要的理论和实际意义。大肠杆菌表达系统是一种简便、高效的原核表达系统，具有成本低、蛋白表达量高、操作简单等特点，并且可以将表达产物与His标签进行共表达，从而可以利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行分离和纯化。亲和层析纯化蛋白具有简单、快速、产物纯度高等优点，是蛋白分离纯化的最好方法之一。N(a) -Benzyloxycarbonyl-L-1ysine Thiobenz (BLT)是一种类膜蛋白酶和颗粒相关的丝氨酸酯酶高度敏感性的底物，被丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A切割后，BLT能够与5,5' -Dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB)反应，在 412nm 处具有最大吸收值。吸光度值越高，说明蛋白活性越好，从而可以用于检测 人颗粒酶A重组蛋白的酶解活性。
技术实现思路
本专利技术提出了一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，包括人活性颗粒酶A重组蛋白的表达、分离纯化及其活性测定。本方法得到的人活性颗粒酶A重组蛋白去除了人颗粒酶A的N末端的28个氨基酸，并在C末端增加了 6个组氨酸，以方便利用镍层析柱对重组蛋白进行纯化。本方法依次包括以下步骤:a)获得人活性颗粒酶A的DNA片段以含有人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a-GzmA为模板，经PCR获得所述人活性颗粒酶A的DNA片段。b)构建重组表达质粒pET24a(+)-aGzmA将所述人活性颗粒酶A基因的DNA片段和原核表达载体pET24a (+)分别用 Nde I和Xho I双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，得到所述pET24a (+) -aGzmA 重组质粒。对pET24a (+)-aGzmA重组质粒进行鉴定:所述pET24a (+)-aGzmA重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态后提取质粒并用Nde I和Xho I双酶切鉴定，得到目的DNA条带，证明 pET24a (+) -aGzmA重组质粒构建成功。c)获得人活性颗粒酶A表达菌pET24a (+) -aGzmA/BL21将重组表达质粒pET24a(+)_aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42°C水浴热击90s ;加入无抗生素培养基培养Ih后涂布于kan+LB平板， 经37°C培养过夜，得到所述人活性颗粒酶A表达菌PET24a(+)-aGzmA/BL21。d)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定将所述人活性颗粒酶A表达菌PET24a(+)-aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至0D600 = 0.6~0.8之间；加入IPTG诱导表达6h 后于12000rpm离心2min，得到含有所述人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体。用PBS重悬菌体后，取样加入2XSDS凝胶上样缓冲液，于100°C煮沸IOmin ;将离心后的上清作为样品，上样后进行SDS-PAGE分析；菌体蛋白经SDS-PAGE分离后转膜，以小鼠抗His多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人活性颗粒酶A的表达。e)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化将工程菌PET24a(+)-aGzmA/BL21用IPTG诱导表达后收集菌体用PBS重悬，置于超声波破碎仪中进行超声破碎；离心收集沉淀，用结合缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl, 5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)重悬，再次离心，收集上清，经0.45iim滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白。在进行人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化前，还可以先对重组蛋白表达形式的进行确定，即步骤d)得到的含有人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体用PBS重悬后`，置于超声破碎仪中进行超声破碎。4°C、12000rpm,离心15min后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析， 检测到人活性颗粒酶A重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。确定重组蛋白表达是包涵体的形式后，将沉淀用结合缓冲液重悬，使包涵体中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次离心，收集获得的上清，0.45um滤膜过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到所述人活性颗粒酶A重组蛋白。为了进一步确定得到的人活性颗粒酶A重组蛋白具有所需的活性，本方法还包括以下步骤:f)人活性颗粒酶A重组蛋白的活性鉴定在96孔板每孔中加入200 ill BLT底物溶液，再加入20 ii I人活性颗粒酶A重组蛋白，37°C放置20min，用酶标仪测定其在412nm处的吸光度值。本方法步骤a)的人活性颗粒酶A基因的PCR扩增中，上游引物序列(SEQ ID N0.1):5? -GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3';下游引物序列(SEQ ID N0.2):5’-C GCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3，。本方法步骤d)所述的诱导剂IPTG终浓度为IMm ;2 X SDS凝胶上样缓冲液的成分包括 IOOmM pH6.8Tris-HCl、20%甘油、4% SDS、200mM2_ 巯基乙醇、0.2%溴酚兰。本方法步骤e)所述镍柱亲和层析纯化是:将NiSO4通过亲和层析凝胶柱以后，Ni2+与凝胶亲和吸附；当带His标记的人活性颗粒酶A重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人活性颗粒酶A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)获得人活性颗粒酶A的DNA片段以含有人颗粒酶A全长基因的质粒pET24a?GzmA为模板，经PCR获得所述人活性颗粒酶A的DNA片段；b)构建重组表达质粒pET24a(+)?aGzmA将所述人活性颗粒酶A基因的DNA片段和原核表达载体pET24a(+)分别用Nde?I和Xho?I双酶切后回收酶切片段，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到所述pET24a(+)?aGzmA重组质粒；c)获得人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)?aGzmA/BL21将重组表达质粒pET24a(+)?aGzmA加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素培养基培养1h后涂布于kan+LB平板，经37℃培养过夜，得到所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)?aGzmA/BL21；d)人活性颗粒酶A重组蛋白的表达和鉴定将所述人活性颗粒酶A表达菌pET24a(+)?aGzmA/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6～0.8之间；加入IPTG诱导表达6h后于12000rpm离心2min，得到含有所述人活性颗粒酶A重组蛋白的菌体；e)人活性颗粒酶A重组蛋白的纯化将所述菌体用PBS重悬，置于超声波破碎仪中进行超声破碎；离心收集沉淀，经重悬、离心，过滤；将过滤后的溶液通过预处理好的镍柱进行亲和层析纯化，得到纯化的人活性颗粒酶A重组蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江文正，胡雪菲，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：