本发明专利技术阐述一种糜蛋白酶的制备方法。该制备方法包括以下工艺步骤：(1)原料绞碎，抽提蛋白；(2)分级盐析，得糜蛋白酶粗品；(3)粗品投料，多重结晶；(4)活化；(5)盐析；(6)透析；(7)冻干。本发明专利技术建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。
【技术实现步骤摘要】
一种糜蛋白酶的制备工艺
本专利技术属于生物制药领域，设计药用糜蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶。
技术介绍
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面一、消炎对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。 二、抗癌能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。中国专利CN1944641A公开了一种糜蛋白酶的制备方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶，但是正如中国专利CN1013025B分析，也存在一些缺点，最主要的，亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足，也能获得高比活的糜蛋白酶，但同样， 比较起传统工艺来，生产成本太高。可是随着糜蛋白酶的应用广泛，使得国际市场对本产品的需求不断扩大，质量要求上也更加严格，要求产品有更高的质量《中国药典》(2010版) 规定，糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对效价提高的要求，本专利技术对传统工艺进行了改进和创新。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种分离提取糜蛋白酶方法，该方法包括如下步骤1、糜蛋白酶粗制生产操作(I)新鲜的胰脏，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，绞碎，称重。(2)绞碎物置塑料桶中，按I 3ml/g的比例加入O. 125mo 1/L硫酸溶液浸溃20 30小时。(3)将浸溃物过滤，滤渣再按I 2ml/g的比例加入O. 125mol/L硫酸溶液浸溃I 3小时，滤干后弃去滤渣。(4)将两次浸溃液合 并置塑料桶中，每IOOOml溶液中加入固体硫酸铵242g，使达 40%饱和度，静置12 16小时。(5)过滤，留取过滤液，固体弃去。(6)在每IOOOml清液中加入固体硫酸铵205g，使达70%饱和度，放置12 16小时。(7)过滤，留取固体，弃滤液。(8)将沉淀物按2 4ml/g的比例加水溶解，再按(4) (5) (6) (7)操作法分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀。(9)取70%饱和度沉淀物，按I 3ml/g的比例加水溶解，再按0. 2 1. 5ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4. 5 5. 5。(10)将溶液静置20 28°C恒温箱中40 50小吋，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品。2、糜蛋白酶精制生产操作(I)结晶エ序投料取糜蛋白酶粗品，按5 9ml/g的比例加水溶解，调pH值至2. 5 3. 5，搅拌8 10小时后，静置12 16小时。结晶I静置结束后搅拌，并调pH值至2. 0 3. O。按I 3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，搅拌10 30分钟，调 pH值至4. 5 5. 5，置20 28°C条件下，保温40 48小时，过滤，收集滤饼，滤液弃去。结晶II按2 4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2. 0 3. 0,再按0. 5 2. 0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4. 5 5. 5，置20 28°C条件下，保温20 24小时,过滤,收集滤饼。结晶III按2 4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2. 0 3. 0,再按0. 5 2. Oml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4. 5 5. 5，置20 28°C条件下，保温20 24小时,过滤,收集滤饼。结晶IV按2 4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2. 0 3. 0,再按0. 5 2. Oml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4. 5 5. 5，置20 28°C条件下，保温20 24小时,过滤,收集滤饼。(2)活化工序称量滤饼重量，按2 4ml/g的比例加入水溶解，调pH值至7. 0 8. 5。再按0. 5 1. 5ml/g滤饼的比例加入磷酸盐缓冲液,搅拌,调节pH值至7. 0 8. 5。加入活化剂胰蛋白酶，比例为3 8mg/100ml料液，活化60 80小吋。(3)盐析エ序活化结束后调pH值至3. 0 5. 0，量取活化液体积，按400 600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析，放置12 16小时。过滤，弃滤液，收集滤饼。(4)透析エ序滤饼按I 1. 5ml/g的比例加入7jC，搅拌溶解，透析4 6天。(5)冻干エ序收集、合并透析液，过滤，量取体积，调pH值至5. 5 6. 7，装盘、冻干。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是本专利技术采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶，通过对传统エ艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的糜蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。本专利技术已建立起一套规模化的生产工艺，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例11、糜蛋白酶粗制生产操作(I)称取新鲜冷冻的牛胰脏4kg，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，绞碎,称重。(2)绞碎物置塑料桶中，用O. 125mol/L硫酸溶液6L浸溃22小时。(3)将浸溃物过滤，滤渣再用O. 125mol/L硫酸溶液4L浸溃I小时，滤干后弃去滤渣。(4)将两次浸溃液合并，量取体积11. 4L，置塑料桶中，加入固体硫酸铵2. 76kg，使达40%饱和度，静置12小时。(5)过滤，留取过滤液，量取体积10. 2L,固体弃去。(6)在过滤液中加入固体硫酸铵2. 1kg，使达70%饱和度，放置12小时。(7)过滤，留取固体，称重116g，弃滤液。(8)将沉淀物用232ml纯化水溶解，再按(4) (5) (6) (7)操作法分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀。(9)取70%饱和度沉淀物65g，用65ml纯化水溶解，加入饱和硫酸铵溶液19. 5ml, 并用5mol/L氢氧化钠溶液调pH4. 7。(10)将溶液静置20°C恒温箱中42小时，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品，称重20. 0g。2、糜蛋白酶精制生产操作(I)结晶工序投料取糜蛋白酶粗品20. OgJP IOOml纯化水溶解，并加适量2. 5mol/L H2S04溶液调节PH2. 6，搅拌8小时后，静置12小时。结晶I静置结束后搅拌，并加2. 5mol/L H2S04溶液调ρΗ2· I。加入饱和硫酸铵溶液20ml， 搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调pH4. 6，置20°C条件下，保温40小时，过滤，收集滤饼，称重 37. 6g,滤液弃去。结晶II滤饼加76ml纯 化水溶解，用2. 5mol/l硫酸调pH2. O,加饱和硫酸铵溶液18. 8ml, 用5mol/L NaOH调pH4. 5，置20°C条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重33. lg。结晶III 滤饼加66. 2ml纯化水溶解，用2. 5mol/L硫酸调pH2. 0，加饱和硫酸铵溶液16.6ml,用5mol/L NaOH调pH4. 5，置20°C条件下，保温20小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原料绞碎，抽提蛋白；(2)分级盐析，得糜蛋白酶粗品；(3)粗品投料，多重结晶；(4)活化；(5)盐析；(6)透析；(7)冻干。
【技术特征摘要】
1.ー种糜蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)原料绞碎，抽提蛋白；(2)分级盐析，得糜蛋白酶粗品；(3)粗品投料，多重結晶；(4)活化；(5)盐析；(6)透析；(7)冻干。2.权利要求1所述制备方法，其特征在于，各步骤具体为 (1)将胰脏绞碎，用硫酸溶液浸溃2次；取滤液，加固体硫酸铵，使达40%饱和度，过滤，取滤液；加固体硫酸铵，使达70%饱和度；过滤，取沉淀物；加水溶解，调pH值至4. 5 5. 5，抽滤，得糜蛋白酶粗品； (2)结晶エ序 糜蛋白酶粗品加水溶解，调PH值至2. 5 3. 5，静置8 12小时； 结晶将糜蛋白酶粗品溶解液再调PH值至2. 0 3. 0 ;加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4. 0 6. 0，置25±3°C条件下，保温20 48小时，过滤，收集滤饼； 滤饼加水溶解，重复上述结晶操作3次，收集滤饼； (3)活化工序 用水溶解上步中所得滤饼，调pH值至7. 0 9. 0 ; 加磷酸盐缓冲液，调PH值至7. 0 9. 0 ;加入活化剂，活化60 80小时； (4)盐析エ序 活化液调pH值至3. 0 5. 0，加入固体硫酸铵进行盐析，过滤，收集滤饼； (5)透析エ序 滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱琳，葛翠凤，刘翠珍，吕金花，
申请(专利权)人：青岛九龙生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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