本发明专利技术涉及采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，包括生产用原料获取，原料粉碎、提取蛋白，分级盐析、酶原沉淀，粗品酶解，亲和层析分离纯化，超滤浓缩除菌，真空冷冻干燥得到成品。与现有技术相比，本发明专利技术体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(＞3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术，尤其是涉及一种。
技术介绍
胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有分解液化血凝块、脓性分泌物、坏死组织等，能使脓液变稀，易于引流并能促进伤口愈合。国内提取胰蛋白酶的工艺长期以来一直采用多重结晶结合透析的工艺，多重结晶工艺复杂、纯化能力弱，透析工艺耗时长、不便于规模化生产，以这种传统工艺生产的产品活性一般在2000-2500单位/毫克，最高只能达到2700单位/毫克左右。根据分析，胰蛋白酶工艺未获得重大突破的原因有二 一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备胰蛋白酶的技术不是那么容易。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工业化的高效手段。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现，其特征在于，该方法包括以下步骤(I)获取生产用原料将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；(2)原料粉碎、提取蛋白用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的O. 25N硫酸溶液，控制温度为4°C搅拌提取3-5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30%饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4°C放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；(3)分级盐析、酶原沉淀在提取液中再补充硫酸铵至70%饱和度，控制温度为4°C放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用I. 5倍重量的冰水溶解沉淀，加入O. 5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25°C下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70%饱和度，控制温度为4°C放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4°C酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液，根据中国药典2010年版第二部的相应方法测定酶解液中胰蛋白酶的效价，进行质量跟踪；(5)亲和层析分离纯化将亲和层析介质装柱，用O. IM Tris-Hcl,pH8. O缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于O. 1，然后用O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl, ρΗ2· 2缓冲液洗脱，流速为50cm/h,收集洗脱峰；(6)超滤浓缩除菌采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过O. 22 μ m的滤膜过滤除菌；(7)真空冷冻干燥得到成品采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品，成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定。步骤(2)中所述的固液分离采用的装置为机电一体化箱式板框过滤设备，而非传统的布袋压滤。所述的硫酸铵为试剂级溶剂。步骤⑷中所述的酶解使用的胰蛋白酶为高纯度的胰蛋白酶,活性> 3300u/mg。步骤(5)中所述的亲和层析介质以GE Health凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基而得，使用的层析缓冲液为O. IM Tris-Hcl，pH8. O缓冲液，使用的洗脱液为O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl,pH2. 2缓冲液,用这种创新的亲和层析纯化方法,可以一步纯化胰蛋白酶，是生产高纯度胰蛋白酶的关键。所述的慈燕蛋白酶抑制剂的加入为10mg/ml凝胶介质。步骤(6)中所述的超滤膜的截流分子量为10000。步骤(7)中所述的真空冷冻干燥中酶液的冷冻温度为-40°C以下。本工艺的路线如下所示新鲜冷冻牛胰或猪胰一粉碎提取一板框过滤一分级盐析一酶原沉淀一酶原酶解—亲和层析一超滤浓缩一除菌过滤一冷冻干燥一成品与现有技术相比，本专利技术建立起一套生产规模的制备工艺，体现出了亲和层析法生产胰蛋白酶的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，以较高的收率得到纯度很高的产品(> 3000单位/毫克)，大大提高了产品的市场竞争力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例I取新鲜冷冻牛胰150公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎。加入450L预冷的O. 25N硫酸溶液，转移到I吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取3小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，得到的清液搅拌加入硫酸铵至30%饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中补充硫酸铵至70%饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀7. 5公斤。用11. 25L冰水溶解沉淀，再加3. 75公斤的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5. O。在25°C下保温静置48小时，过滤得到滤液，再加20公斤的饱和硫酸铵溶液，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得酶原粗品2. 5公斤。粗品用25L去离子水溶解，调节PH到8. O,再加入125mg胰蛋白酶(效价3400单位/毫克)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将IOL自制的亲和层析介质装柱，用30L O. IM Tris-Hcl,4PH8. O缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用30L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD28tl值小于O. I。换用O. lmol/L甲酸-O. 05mol/L KCl,pH2. 2缓冲液洗脱，流速为50cm/小时，收集洗脱峰20L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至4. 5L，将浓缩液通过O. 22 μ m的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2010年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到3350单位/毫克。实施例2取新鲜冷冻牛胰450公斤，用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆。加入1350L预冷的O. 25N硫酸溶液，转移到2吨搅拌容器中，在4度冷库中搅拌提取5小时，放置过夜。次日用板框过滤设备过滤，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，在清液中搅拌加入硫酸铵至30%饱和度，并加入少量硅藻土助滤，在4度冷库中放置过夜后过滤得到提取液。在提取液中再补充硫酸铵至70%饱和度，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，离心得到沉淀23公斤。用34. 5L冰水溶解沉淀,再加11. 5公斤的饱和硫酸铵溶液,调节pH至5.O。在25°C下保温静置48小时，过滤得到滤液，再加60公斤的饱和硫酸铵溶液，在4度冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得酶原粗品7. 2公斤。粗品用72L去离子水溶解，调节pH到8. O,再加入360mg胰蛋白酶(效价3400单位/毫克)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将25L自制的亲和层析介质装柱，用75LO.IM Tris-Hcl, pH8. O缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/小时；上样完毕，用75L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD28t本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用亲和层析法生产高纯度胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)获取生产用原料：将新鲜的牛胰或猪胰进行冷冻保存，得到冷冻原料；(2)原料粉碎、提取蛋白：用粉碎机将冷冻原料直接粉碎成浆状，加入三倍体积预冷的0.25N硫酸溶液，控制温度为4℃搅拌提取3？5h，放置过夜，次日将提取液进行固液分离，在清液中加入硫酸铵至30％饱和度，并加入硅藻土助滤，控制温度为4℃放置过夜后过滤，得到的清液即为提取液；(3)分级盐析、酶原沉淀：在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，用1.5倍重量的冰水溶解沉淀，加入0.5倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至5，在25℃下保温静置48h，过滤收集滤液，再补充硫酸铵至70％饱和度，控制温度为4℃放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀，得到胰蛋白酶粗品；(4)粗品酶解：胰蛋白酶粗品用10倍体积的去离子水溶解，调节pH到8.0，在每升溶解液中加入5mg高纯胰蛋白酶，控制温度为4℃酶解48h，酶解后的溶液离心得到酶解液；(5)亲和层析分离纯化：将亲和层析介质装柱，用0.1M？Tris？Hcl，pH8.0缓冲液作为平衡液进行平衡，平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕，用上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后用0.1mol/L甲酸？0.05mol/L？KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰；(6)超滤浓缩除菌：采用超滤膜对收集的洗脱峰进行浓缩，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌；(7)真空冷冻干燥得到成品：采用真空冷冻干燥技术，将过滤除菌后得到的酶液直接冷冻干燥，即得到高纯度胰蛋白酶成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶昀，林克，王洪森，朱吉源，
申请(专利权)人：上海林叶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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