本发明专利技术公开了一种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，本发明专利技术通过化学全合成胰蛋白酶酶原基因连接到毕赤酵母GS115（Pichia?pastoris）染色体上，构建了一株高效分泌表达胰蛋白酶酶原的基因工程菌，发酵3～4天后，可得到链霉菌胰蛋白酶酶原的表达，解决了长期无法从野生灰色链霉菌中获得胰蛋白酶酶原的问题。应用该菌种生产胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于基础中进行链霉菌晶体结构研究及其激活机理研究之用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及与应用，特别是一种高产胰蛋白酶酶原的基因工程菌及构建方法与应用，属于生物
技术介绍
链霉菌胰蛋白酶(SGT) (E. C. 3. 4. 21. 4)是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其在氨基酸编码基因结构上属于pre-pro-protease类型,而通过对灰色链霉菌的基因组测序发现编码SGT的基因SprT中，除去SGT自身信号肽和链霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端还具有一段前导肽(-Ala-Pr0-Asn-Pr0-)(图I);通过前人对链霉菌胰蛋白酶在灰色链霉菌中的分泌，纯化，氨基酸测序以及相关生理生化功能的研究，发现在链霉菌气生菌丝和营养菌丝分化时，链霉菌胞外开始出现活性胰蛋白酶，纯化和氨基酸测序也仅 能获得活性的胰蛋白酶的信息，而带有前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化机理却未有见到报道，并且对于链霉菌胰蛋白酶酶原的获得也未有报道，因此建立获得在N端具有野生前导肽的胰蛋白酶酶原的方法，对于链霉菌胰蛋白酶酶原晶体结构的研究，以及其激活机理的研究具有至关重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种产胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因工程菌，其特征在于染色体上携带有胰蛋白酶酶原(trypsinogen)基因(pmt)。所述胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因序列为SEQ ID N0:1。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图I :第一步链霉菌胰蛋白酶酶原基因的获得及分析首先，合成灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶基因其次，毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达系统有着特殊的密码子偏好性,如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母(Pichia pastoris)可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过胰蛋白酶酶原基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数(CAI)分析，发现在胰蛋白酶酶原基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在类胰蛋白酶基因上下游分别加入EcoRI限制性内切酶位点和NotI限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为SEQ ID NO: I ;第二步链霉菌胰蛋白酶酶原重组质粒的构建为了使pmt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用pmt基因序列5'端的EcoR I限制性内切酶位点与3'端的Not I限制性内切酶位点，将pmt基因克隆入载体PPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有pmt基因的载体与要连接的表达载体PPIC9K进行EcoRI和NotI酶切，连接得到含有pmt基因的重组质粒pPIC9K-pmt。第三步链霉菌胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建将重组质粒pPIC9K_pmt电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达胰蛋白酶酶原的组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含胰蛋白酶酶原基因的重组表达质粒pPIC9K_pmt可转化毕赤酵母(Pichia pastoris),成为能分泌表达外源类胰蛋白酶的功能酵母菌由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-pmt上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-pmt可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA上。在外源诱导 物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源pmt基因，信号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GS115 —环于25mLYPD液体培养基中，28°C 30°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液体培养基中，28°C 30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度0D600为I. 3 I. 5，在冰水中冷却IOmin以上，然后在4°C环境下，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置lOmin，如此重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次，用300 μ L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞,从而获得受体菌。然后取50 80 μ L受体菌和5 90 μ g线性化重组表达质粒DNA混匀，电击(电压1500V :电容25 μ F ;电阻200 Ω )处理，然后涂布于卡那霉素(10 μ g/mL)抗性平板筛选重组子。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的应用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案第一步重组菌株的筛选所述重组表达质粒pPIC9K_pmt上含有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经整合到染色体上，重组菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生长；涂布含卡那霉素G418抗性平板，挑取阳性转化子，对转化子进行PCR验证，阳性即为产胰蛋白酶酶原基因工程菌。第二步菌株经培养分泌胰蛋白酶酶原培养基组成(g/L):种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15 ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15，生物素O. 0002 O. 0005,甲醇10 50 ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100, ZnCl270, Na2MoO4 · 2H2035, H3B0360, CoCl2 · 6H20200,CuSO4 · 5H2029, NiCl2 · 6H2025, 37% 盐酸 0. 9mL。优选培养基组成(g/L ):种子培养基蛋白胨15g/L,酵母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15g/L，生物素O. 0002 O. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 · 6H20200g/L, CuSO4 · 5H2029g/L, NiCl2 · 6H2025g/L, 37% 盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28°C 30°C，摇床转速200r/min，培养24h ；发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，发酵时间3 4天。胰蛋白酶酶原检测方法将诱导获得的胞外上清进行SDS-PAGE检测，并同空白宿主菌作对比，按照理论分 子量估算链霉菌胰蛋白酶酶原分子量约为25kDa左右(图3)，同空白对照相比在相应蛋白条带处出现的条带即表明链霉菌胰蛋白酶酶原的表达。有益效果本专利技术的优点在于构建了一株高效分泌表达胰蛋白酶酶原的毕赤酵母基因工程菌，解决了胰蛋白酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用重组基因工程菌获得链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，其特征在于以重组基因工程菌毕赤酵母GS115为种子，活化后按10%的接种量接入发酵培养基中中，控制发酵温度30℃，摇床转速200r/min，发酵3？4天，所述重组基因工程菌染色体上携带有胰蛋白酶酶原的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，令桢明，堵国成，康振，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。