一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获得杂交链霉菌胰蛋白酶酶原及其及其在产活性链霉菌胰蛋白酶中的应用，通过将体外所得的胰蛋白酶酶原基因连接到毕赤酵母GS115（Pichia?pastoris）染色体上，构建了一株高效分泌表达杂交胰蛋白酶酶原的基因工程菌，发酵3～4天后，可得到杂交胰蛋白酶酶原的表达(图3(A)，解决了基础研究中获得杂交灰色链霉菌胰蛋白酶酶原的问题。并且通过肠激酶切割活化得到具有活性的链霉菌胰蛋白酶，活化后酰胺酶活力可达到1.4U/ml(图3(B))。应用该菌种生产杂交胰蛋白酶酶原，产量高、工艺简单、便于基础研究中胰蛋白酶酶原晶体结构的研究和应用，并且提供了一种通过活化杂交胰蛋白酶酶原获得活性链霉菌胰蛋白酶的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种链霉菌胰蛋白酶酶原，特别是一种杂交胰蛋白酶酶原及其应用，属于生物

技术介绍
链霉菌胰蛋白酶(SGT) (E. C. 3. 4. 21. 4)是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其在氨基酸编码基因结构上属于pre-pro-protease类型,而通过对灰色链霉菌的基因组测序发现编码SGT的基因SprT中， 除去SGT自身信号肽和链霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端还具有一段前导肽(-Ala-Pr0-Asn-Pr0-)(图I);通过前人对链霉菌胰蛋白酶在灰色链霉菌中的分泌，纯化，氨基酸测序以及相关生理生化功能的研究，发现在链霉菌气生菌丝和营养菌丝分化时，链霉菌胞外开始出现活性胰蛋白酶，纯化和氨基酸测序也仅能获得活性的胰蛋白酶的信息，而带有前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化机理却未有见到报道。而与其结构及性质较为相似的牛胰蛋白酶的产生是通过胰脏产生肠激酶活化胰蛋白酶酶原来产生活性胰蛋白酶，具体的激活机理肠激酶特异性识别并切割胰蛋白酶前导肽，而哺乳动物胰蛋白酶酶原前导肽氨基酸序列正好是肠激酶酶切特异性识别序列(-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-)(图I.)。因此,鉴于链霉菌中带有野生前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原激活的具体机理未有相关报道，并且根据链霉菌活性胰蛋白酶和活性牛胰蛋白酶具有相似的氨基酸组成和蛋白质结构，拟通过构建基因工程菌，建立获得在N端具有牛胰蛋白酶酶原前导肽的链霉菌胰蛋白酶酶原的方法，对于杂交链霉菌胰蛋白酶酶原晶体结构的研究，以及其激活机理的研究具有至关重要的意义，并且为生产活性链霉菌胰蛋白酶提供了一种方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种产杂交胰蛋白酶酶原(hybridizedtryspinogen)的基因工程菌,其特征在于染色体上携带有杂交胰蛋白酶酶原(hybridizedtryspinogen)基因(smt)。所述杂交胰蛋白酶酶原(hybridized tryspinogen)的基因序列如SEQ ID NO: I所/Jn o本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种杂交胰蛋白酶酶原基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图I :第一步胰蛋白酶酶原基因的获得及分析首先,化学全合成灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶其次,毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达系统有着特殊的密码子偏好性,如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母(Pichia pastoris)可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过类胰蛋白酶基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数(CAI)分析，发现在类胰蛋白酶基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在类胰蛋白酶基因上游加入EcoR I限制性内切酶位点以及来源于牛胰蛋白酶酶原的前导肽编码序列，在其下游部分加入Not I限制性内切酶位点，进行体外扩增类胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为SEQ ID NO: I ；第二步杂交胰蛋白酶酶原重组质粒的构建为了使smt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用smt基因序列5/端的EcoR I限制性内切酶位点与3'端的Not I限制性内切酶位点，将smt基因克隆入载体PPIC9K。由于在AOXI强启动子后面 有一段a-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有smt基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行EcoR I和Not I酶切，连接得到含有SprT基因的重组质粒pPIC9K-smt。第三步类胰蛋白酶基因工程菌的构建将重组质粒pPIC9K-smt电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含类胰蛋白酶基因的重组表达质粒pPIC9K_pmt可转化毕赤酵母(Pichia pastoris),成为能分泌表达外源类胰蛋白酶的功能酵母菌由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-smt上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-smt可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源smt基因，信号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GSl 15 —环于25mL YPD液体培养基中，28°C 30°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液体培养基中，28°C 30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度OD6qq为I. 3 I. 5，在冰水中冷却IOmin以上，然后在4°C环境下，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置lOmin，如此重复步骤4三次，即无菌水洗漆3次,用300 ii L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞,从而获得受体菌。然后取50 80 y L受体菌和5 90 ii g线性化重组表达质粒DNA混匀，电击(电压1500V :电容25 y F ;电阻200 Q )处理，然后涂布于卡那霉素(10 u g/mL)抗性平板筛选重组子。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种胰蛋白酶酶原基因工程菌的应用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案第一步重组菌株的筛选所述重组表达质粒pPIC9K_smt上含有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经整合到染色体上，重组菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生长；涂布含卡那霉素G418抗性平板，挑取阳性转化子，对转化子进行PCR验证，阳性即为产胰蛋白酶酶原基因工程菌。第二步菌株经培养分泌杂交胰蛋白酶酶原培养基组成(g/L):种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15 ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15，生物素0. 0002 0. 0005,甲醇10 50 ;微量元素溶液，MnSO4 4H20100, ZnCl270, Na2MoO4 2H2035, H3B0360, CoCl2 6H20200,CuSO4 5H2029, NiCl2 6H2025, 37% 盐酸 0. 9mL。优选培养基组成(g/L ):种子培养基蛋白胨15g/L,酵 母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12 15g/L，生物素0. 0002 0. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 6H20200g/L, CuSO4 5H2029g/L, NiCl2 6H2025g/L, 37% 盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交链霉菌胰蛋白酶酶原，其特征在于其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，令桢民，堵国成，康振，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：