融合蛋白、由多个所述融合蛋白的单体组成的纳米颗粒及其用途制造技术

描述了基于人类铁蛋白重链的融合蛋白，其在蛋白质的N末端包含至少一种金属蛋白酶切割序列以及作为增加蛋白质‑药物稳定性的掩蔽聚合物的PAS多肽，以及由所述融合蛋白的多个单体组成的纳米颗粒，编码所述融合蛋白的核酸及其诊断性和治疗性应用。

Fusion protein, nanoparticle comprising a plurality of monomers of the fusion protein and uses thereof

Describes the fusion of human ferritin heavy chain protein based, comprising at least one metal protease cleavage sequence and increase stability of polymer as masking proteins of PAS polypeptide in the N terminus of the protein, the fusion protein of multiple monomers consisting of nanoparticles, nucleic acids encoding the fusion protein and its the diagnosis and treatment of.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白、由多个所述融合蛋白的单体组成的纳米颗粒及其用途
本专利技术涉及融合蛋白、由多个所述融合蛋白的单体组成的纳米颗粒、编码所述融合蛋白的核酸及其诊断性和治疗性的应用。
技术介绍
治疗剂在患病区域的选择性释放是改善目前疗法的最重要挑战中的一种。在这种环境下，使用纳米颗粒作为治疗剂的载体(纳米载体)潜在地允许避免可能存在于施用部位和最终靶标之间的生物屏障，以及更具体地，以选择性方式在患病区域而不是正常组织处积聚药物。作为基本的先决条件，纳米载体必须能够以有效的方式结合大量的药物。在已知的用于靶向药物释放的载体中，由于基于铁蛋白(Fts)的纳米颗粒的生物相容性、穿过生物屏障的能力、功能化多样性以及结合某些类型药物的性能的优异特征，其变得越来越令人关注(Vannucci,L.,Falvo,E.,Ceci,P.MultifunctionalProtein-BasedNanoparticlesforCancerTheranosis.2014,A.Prokop等人(编辑),IntracellularDeliveryII,FundamentalBiomedicalTechnologies7)。Fts是高度对称的由24个组装成具有基本上球形壳的分子结构的亚基组成的多聚蛋白质结构，其包围生理学上用于储存铁的腔。外径和内径分别为12和8nm。在下文中这种壳状分子结构将被称为“纳米颗粒”或“HFt纳米颗粒”。与其它药物释放系统相比，基于人类铁蛋白重链(HFt)的纳米颗粒显示出许多优点，特别是与体内人类应用相关。事实上，HFt分子被设计成穿过生物屏障(20nm小直径)，并且在生理条件下存在于细胞内和血液中，尽管以低浓度(约20μg/L)。作为天然元素，它们不太可能引起强烈的非自身(外来)抗体和/或T细胞免疫应答。此外，HFt是能够以有效的和选择性方式由其自身结合肿瘤细胞的少数天然纳米颗粒中的一种。事实上，通过使用用于靶向癌症治疗的最有吸引力的分子中的一种，转铁蛋白受体1(TfR1)，已经显示了HFt被内在化。TfR1确实在许多类型癌症的表面上上调(比正常细胞高达100倍)，并且被有效地内化。在超过474个临床组织样本中，证明了HFt而非人类铁蛋白轻链(LFt)被TfR1内在化，并且与非肿瘤组织相比，特异性识别许多类型的肿瘤(即，肝、肺、胰腺、结肠、子宫颈、卵巢、前列腺、乳腺、肉瘤和胸腺癌)具有98％的敏感性和95％的特异性(FanK,CaoC,PanY,LuD,YangD,FengJ等人,Magnetoferritinnanoparticlesfortargetingandvisualizingtumourtissues.NatNanotechnol.2012；7:459-64)。然而，天然HFt表现出一些缺点。首先，其能够结合某些类型药物，如例如阿霉素(具有广泛抗肿瘤谱的抗肿瘤药物中的一种)的收率较低，并且这可能限制其可能的用途和临床发展。其次，当通过全身性途径注射时，天然HFt具有非常短的血浆半衰期，约2-3小时。最后，其天然的铁氧化酶活性可能抑制人类成骨细胞的发育和成熟，并导致矿化降低、骨质减少和骨质疏松(ZarjouA,JeneyV,ArosioP,PoliM,ZavaczkiE,BallaG,BallaJ.Ferritinferroxidaseactivity:apotentinhibitorofosteogenesis.JBoneMinerRes.2010,25:164-72)。因此，建议使用不具有抑制作用的通过位点特异性突变(在下文中称为vHFt)获得的缺乏铁氧化酶活性的HFt变体。
技术实现思路
为了同时地解决以上列出的关于天然HFt的所有缺点，本专利技术人决定通过直接作用于蛋白质的外表面来从遗传学角度修饰人类铁蛋白重链(HFt)。在这样做的过程中，显著且令人惊奇地提高了将药物阿霉素封装在蛋白质腔内的能力，并且延长了血浆半衰期，而不影响蛋白质识别肿瘤细胞的能力。通过如所附权利要求1中所定义的融合蛋白实现了以上和其它目的。其它独立权利要求和从属权利要求涉及本专利技术的其它方面和具体实施方式，其形成说明书的组成部分。附图说明本专利技术的其它特征和优势将出现于以下详细说明中，参照附图，提供该详细说明仅仅用于举例说明的目的而非以限制的方式，其中：图1是制备HFt纳米颗粒的示意图，其中将24个单体中的每一个的N末端以遗传的方式结合至可切割的肽序列以及结合至基本上由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸(PAS)组成的序列。为了清楚起见，仅显示了24个N末端中的5个。图2是制备携带治疗性分子和/或诊断性分子的HFt纳米颗粒的示意图。可以将该分子装载在内腔中或结合至蛋白质的外表面。图3是描述HFt纳米颗粒在肿瘤细胞上作用的模式的总体图。图4通过SDS-PAGE然后以考马斯亮蓝R-250染色示出了已建立的构建体中的一种，HFt-MMP-PAS75(PAS长度：75个残基)的蛋白质表达谱。通过使用IPTG诱导性质粒pet-11a在大肠杆菌(E.coli)BL21DE3中制备重组蛋白，并且如与实施例相关的部分所描述的进行纯化。泳道1：非IPTG诱导细胞的可溶性成分和不溶性成分(fraction)的SDS-PAGE。泳道2：用0.5mMIPTG诱导细胞的可溶性成分和不溶性成分的SDS-PAGE。HFt-MMP-PAS条带由黑色箭头表示，并以大约40kDa迁移，与计算质量28.5kDa完全不同。这种现象与其它的对于PAS化的(PASylated)蛋白质所报道的一致，并且是由于PAS序列的SDS结合降低。此外，PAS序列与考马斯亮蓝染色微弱，导致低估凝胶中的蛋白质条带。图5示出了天然HFt(点线)和融合蛋白构建体HFt-MMP-PAS75(实线)，HFt-MMP-PAS40(断线和点线)或用聚乙二醇(PEG)5kDa官能化的HFt(HFt-PEG5K，断线)的尺寸排阻色谱图。图6示出了在体外由蛋白酶MMP-2/9(胶原酶IV)除去PAS之前(实线)和之后(点线)的HFt-MMP-PAS75的典型尺寸排阻色谱图。图7示出了在体外由蛋白酶MMP-2/9(胶原酶IV)除去PAS之前和之后的HFt-MMP-PAS75条带的迁移谱。用考马斯亮蓝R-250染色SDS-PAGE。泳道1：蛋白质标记；泳道2：HFt(1mg/ml)；泳道3：用0.2mg/mlMMP-2/9蛋白酶(胶原酶IV)体外消化后的HFt-MMP-PAS75(2mg/ml)；泳道4：用0.2mg/mlMMP-2/9蛋白酶(胶原酶IV)体外消化后的HFt-MMP-PAS75(2mg/ml)。图8示出了由建立的构建体中的两个(HFt-MMP-PAS40和HFt-MMP-PAS75)与天然HFt蛋白质和来自文献的其它数据相比的封装阿霉素的能力。相对收率以％蛋白质回收率和封装的阿霉素分子数量表示。可以看出，与天然HFt相比，本专利的构建体主题令人惊讶地和出乎意料地已经获得了至少6倍的封装药物阿霉素的改善能力。图9示出了在280nm(实线)和485nm(点线)读数的HFt-MMP-PAS40-DOXO的典型尺寸排阻色谱图。图10示出了在％药物释放随时间在4℃和37℃下的铁蛋白-阿霉素复合物(HFt-DOXO，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含至少三个结构域的融合蛋白，其中：(a)第一结构域包含天然人类铁蛋白重链的氨基酸序列或它们的与所述天然人类铁蛋白重链的所述氨基酸序列具有至少90％同一性的变体；(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；以及(c)第三N末端结构域由至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸(PAS)组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.30 IT TO2014A0007791.一种包含至少三个结构域的融合蛋白，其中：(a)第一结构域包含天然人类铁蛋白重链的氨基酸序列或它们的与所述天然人类铁蛋白重链的所述氨基酸序列具有至少90％同一性的变体；(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；以及(c)第三N末端结构域由至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸(PAS)组成。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述PAS具有低于80个氨基酸残基、优选在20至80个氨基酸残基之间、更优选在40至75个氨基酸残基之间的长度。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述第一结构域包含天然人类铁蛋白重链的氨基酸序列SEQIDNO：1或人类铁蛋白重链变体的氨基酸序列SEQIDNO：2。4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中，所述第二结构域包含选自由MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9所组成的组中的基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的所述氨基酸序列选自由SEQIDNO：3-8所组成的组。6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中，前...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮耶尔保罗·塞西，伊丽莎白·法尔沃，
申请(专利权)人：西纳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利,IT